背景和目的先天性泌尿系统发育异常(Congenital anomalies of the kidney and urinary tract,CAKUT)是一类多样化的先天性结构畸形,主要由于肾脏在胚胎期发育缺陷所引起的。CAKUT在所有先天性结构畸形中占的比例约为20-30%,而在活产儿中的发病率约为3-6/1000。肾脏发育异常的疾病谱较为广泛,从轻度肾积水到严重的双侧肾脏发育不良等。大部分CAKUT患者的病因至今仍然未知,但越来越多的证据显示基因组的不平衡改变会导致泌尿系统的发育异常从而出现疾病状态。人类和小鼠的遗传学的进展使得我们对CAKUT的病理生理学有了进一步的了解。而与影响肾脏发育的转录因子或者信号转导通路相关的基因发生突变则会导致CAKUT的出现。大量的研究数据显示约有1/3的CAKUT患者是由于遗传物质的改变如拷贝数变异、基因组异常以及新发的基因突变等所造成的。目前,临床上应用遗传学诊断的最大障碍仍然是基因型-表型之间相关性的知识的缺乏。然而,CAKUT遗传学病因的鉴定将不仅对肾脏以外的并发症诊断提供帮助,还有助于评估产后患者的肾脏功能和预后。目前用于检测CAKUT新的致病基因的方法很多,主要包括候选基因研究、全基因组关联分析、拷贝数变异(copy number variant,CNV)分析以及全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)。而后两种方法目前越来越受欢迎。传统的分析技术可以检测大片段的染色体缺失/重复,主要有标准的核型分析技术和荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization,FISH),二者的分辨率介于500kb到5Mb之间。而<5Mb的拷贝数变异片段(copy number variants,CNVs)只能由高分辨率的全基因组染色体微阵列分析技术(chromosomal microarray analysis,CMA)进行检测。该技术主要包括微阵列比较基因组杂交技术(array comparative genomic hybridization,array-CGH)和单核苷酸多态性微阵列技术(single nucleotide polymorphism microarrays,SNP-arrays)。这两种类型的芯片平台均具有高通量,高分辨率,周期短的特点,至少能检测到500bp大小的CNVs。但均不能检测染色体平衡性改变,如点突变等。目前对不明原因的疾病行遗传学诊断常用的检测流程是CNV分析再到WES。WES技术检测范围覆盖基因组中的所有的编码区域。人类外显子组区域只占全基因组序列的~1%-2%,但覆盖了~85%的已知致病基因突变位点。WES既可以用于检测已知的疾病相关基因又可以发现新的疾病相关基因。在NIH的一项研究中发现WES可对将近20%的罕见疾病的患者进行基因诊断。本研究中,我们用传统的染色体核型分析技术、染色体微阵列分析技术以及全外显子测序技术对的453例CAKUT胎儿进行分析,旨在:1)分别从细胞、基因组和基因水平探讨CAKUT胎儿的遗传学病因;2)比较分析传统的核型分析技术、CMA技术和WES技术在CAKUT胎儿中应用的优越性和局限性;3)为建立先天性泌尿系统畸形的遗传学诊断以及产前诊断的临床操作流程提供理论依据。第一部分染色体核型分析技术和染色体微阵列技术在产前先天性泌尿系统异常胎儿中的应用方法1、选取2012年8月到2016年8月在广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心进行侵入性产前诊断的CAKUT胎儿样本453例及其父母样本。根据CAKUT(伴或不伴其他异常)亚型将胎儿样本分为:肾脏回声增强(n=21)、重复肾(n=25)、多囊性肾发育不良(n=73)、多囊性肾病(n=31)、肾积水(n=172)、肾脏增大伴或不伴回声增强、肾发育不良(n=29)、肾缺如(n=64)、异位肾(n=13)、马蹄肾(n=5)以及肾囊肿(n=5)。根据是否合并其他肾外异常将胎儿样本分为3组:孤立性CAKUT组(n=324)、CAKUT合并软指标组(n=62)和CAKUT合并其他系统畸形组(n=67)。2、选取得377例胎儿样本,按照标准的操作流程进行细胞培养、G-显带染色体核型分析。3、用盐析法血液DNA提取试剂盒I提取胎儿样本(绒毛、羊水细胞和脐血)及其家系外周血白细胞中的全基因组DNA,并使用Sim-100对DNA的浓度和纯度进行测量。4、根据美国Affymetrix公司的Cyto Scan HD芯片平台(195万拷贝数探针和75万SNP探针)的标准实验操作流程对210例胎儿样本DNA进行处理,包括染色体核型异常11例,染色体核型结果正常123例以及首选CMA进行检测的76例。5、使用相配套的CHAS软件对扫描芯片产生的.CEL文件进行数据分析。6、根据DGV(含正常人的CNVs)、DECIPHER(含患者的表型及致病性片段)、OMIM(含已知的致病基因)、CAGdb、ISCA(含良性与致病性的CNVs)、UCSC Genome Browser(显示片段中基因的内容及功能)及PUBMED等以及本实验室的内部数据库对分析结果进行在线比对,判断CNVs的性质。7、针对致病性CNVs和临床意义不明确的CNVs结果,进一步行父母样本检测进行综合家系分析,明确CNVs的来源和性质。8、采用统计学软件SPSS 13.0中的卡方检验比较分析。结果1、453例CAKUT胎儿样本中377例(83.22%,377/453)接受了染色体核型分析。结果显示353例(77.92%,353/377)胎儿的染色体核型分析未见异常;而24例(6.37%,24/377)中可见异常。其中孤立性CAKUT组,染色体核型异常检出率为3.97%(11/277);CAKUT合并软指标组,检出率为9.09%(5/55);CAKUT合并其他系统畸形组,检出率为17.78%(8/45)。采用卡方检验进行两两比较,a=0.017为检验水准,结果发现孤立性CAKUT组和CAKUT合并其他系统畸形组异常检出率之间的差异有统计学意义(3.97%vs 17.78%,P=0.001);其他组别之间的差异均无统计学意义(P>0.017)。2、24例核型异常的胎儿中11例进一步接受CMA检测,结果发现4例含有致病性CNVs,1例含有VOUS,6例含有良性CNVs。3、353例核型结果正常的CAKUT胎儿中123例选择进一步行CMA检测,结果发现11例(8.94%)胎儿含有致病性CNVs;5例(4.07%)含有VOUS,107例(86.99%)含有良性CNVs。4、453例CAKUT胎儿样本中76例未进行染色体核型分析,而是首选CMA进行检测,结果发现16例(21.05%)胎儿含有致病性CNVs;其中CNVs>10Mb的病例数为11例(14.47%,11/76),CNVs≤10Mb的病例数为6例,检出率为7.89%(6/76)。3例(3.95%)患儿含有VOUS,57例(75%)患儿含有良性CNVs。采用卡方检验进行比较,a=0.05为检验水准,结果发现CMA一线检测对>10Mb的致病性CNVs检出率和染色体核型分析结果异常的检出率之间的差异有统计学意义(P=0.016);CMA一线检测对≤10Mb的致病性CNVs检出率与核型正常CAKUT胎儿的CMA结果之间的差异无统计学意义(P=0.797)。5、210例接受CMA检测的CAKUT胎儿病例中,孤立性CAKUT组致病性CNVs检出率为10.88%(16/147),CAKUT合并软指标组的为14.81%(4/27),CAKUT合并其他系统畸形组的为30.56%(11/36)。采用卡方检验进行两两比较,a=0.017为检验水准,结果发现孤立性CAKUT组和CAKUT合并其他系统畸形组致病性检出率之间的差异有统计学意义(10.88%vs 30.56%,P=0.003);其他组别之间的差异无统计学意义(P>0.017)。31例含有致病性CNVs的胎儿病例中,致病性检出率依次为肾脏回声增强33.33%(4/12)>重复肾23.81%(5/21)>多囊性肾发育不良23.53%(8/34)>多囊性肾病17.65%(3/17)>肾积水15.80%(9/57)>肾脏增大伴或不伴回声增强9.09%(1/11)>肾发育不良7.69%(1/13)>肾缺如、异位肾、马蹄肾和肾囊肿(检出率均为0)。6、210例接受CMA检测的CAKUT胎儿病例中,31例含有致病性CNVs,其中染色体数目异常10例,占32.26%;已知的微缺失/微重复综合征11例,占35.48%;其余11例(35.48%,11/31)为非综合征致病性片段。此外,HNF1B、AGT和REN基因为已知的CAKUT致病性基因,而NPHP1、KCNJ1为CAKUT的候选基因。结论1、在CAKUT胎儿样本中染色体核型异常的检出率为6.37%,再次证明了泌尿系统异常的胎儿与染色体异常有相关性,尤其是合并其他系统畸形者。2、对于孤立性CAKUT,孤立性肾盂肾盏扩张和单侧肾缺如病例没有必要行染色体核型分析,但孤立性MCKD和HDN尚存在争议,因此,产前孤立性CAKUT行染色体核型分析需慎重。3、CMA技术可以弥补了传统核型分析的不足,进一步明确异常片段的大小、性质、来源以及片段内所含的基因,为产前咨询和胎儿预后评估提供更确切遗传学依据。4、CMA能将核型正常的CAKUT胎儿样本的致病性CNVs的检出率提高8.94%。同时具有识别致病基因的能力:HNF1B、AGT和REN基因为已知的CAKUT致病性基因,而NPHP1、KCNJ1为CAKUT的候选基因。5、CMA可以取代传统核型分析技术应用于产前结构异常的胎儿中。但是CMA不能检测平衡易位/倒位、组织嵌合体,也不是所有CMA均能检测三倍体(array CGH),所以核型分析技术仍然需要用于临床中以弥补CMA的不足。6、CAKUT合并其他系统畸形时基因组拷贝数变异的风险增加,不同的CAKUT亚型基因组拷贝数变异的风险也不同:肾脏回声增强>重复肾>多囊性肾发育不良>多囊性肾病>肾积水>肾脏增大伴或不伴回声增强>肾发育不良。7、本研究中17q12微缺失综合征、22q11.2微缺失综合征和Williams-Beuren综合征较常见。而非综合征型CNVs:16q13q24.3重复、2q14.3-q24.3重复、3p26.1微缺失、4q35.2微缺失、17p12微缺失、17p13.3微重复在CAKUT病例中首次报道,丰富了该类微缺失/微重复的疾病表型谱。8、CMA检测后尚有较多VOUS和良性CNVs病例,不排除含有CMA分辨率以下的微缺失/微重复和基因突变的可能性,建议进一步行NGS检测以明确诊断。第二部分全外显子组测序技术在先天性泌尿系统异常胎儿中的应用方法1、选取2014年2月到2016年2月在广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心进行侵入性产前诊断的CAKUT伴或不伴其他畸形的胎儿样本30例。染色体核型和CMA结果均未见明显异常。其中22例为孤立性CAKUT样本,8例为CAKUT合并其他异常样本。根据是否用WES对核心家系进行检测将胎儿样本分为2组:G1组,即WES只对胎儿样本进行检测(n=23);G2组,即WES对核心家系进行检测(n=7)。2、用盐析法血液DNA提取试剂盒I提取胎儿样本(绒毛、羊水细胞和脐血)及其家系外周血白细胞中的全基因组DNA,并使用Nanodrop分光光度计对DNA的浓度和纯度进行测量。3、使用DNA文库构建试剂盒,实验步骤参照说明书依次进行末端补平、3’端腺苷化、接头连接、片段选择、扩增的过程,完成DNA文库的构建。4、用Nimble Gen捕获磁珠与Hybridization and Wash Kit试剂盒进行目标区域的捕获,用高保真DNA聚合酶对目标区域进行PCR扩增。5、使用Hiseq 2500高通量模式,进行PE100测序,按Hiseq 2500标准流程进行作业。6、用Illumina官方basecall分析软件Bcl To Fastq得到原始数据(raw data)。并转换成FASTQ格式的文件。对原始数据进行过滤获得高质量的数据(clean data)。然后依次进行数据比对、变异检测、突变注释、蛋白质危害性预测、剪切危害性预测以及生物学分析。7、突变位点根据ACMG(American College of Medical Genetics and Genomics)指南标准进行判定,分为以下5类:致病性、可能致病性、不明确、可能良性和良性。8、用一代测序(Sanger测序)的方法对致病性、可能致病性突变位点的胎儿及父样本进行验证。结果1、WES对30例核型及CMA结果未见异常的CAKUT伴或不伴其他异常的胎儿样本进行检测,结果在4例样本中检测到致病性突变,在2例样本中检测到偶发变异。WES在该CAKUT胎儿群体中致病性检出率为13.3%(4/30)。2、4例致病性样本中,孤立性CAKUT致病性检出率为9.1%(2/22),而CAKUT合并其他异常的检出率为25%(2/8)。3、致病性突变所涉及的基因分别为UMOD、NEK8、HNF1B和BBS2基因;偶发变异所涉及的基因分别为HSPD1和GRIN2B基因。4、G1组的周转时间是11-12周,而G2组的周转时间是8-9周。结论1、WES能提高产前诊断中不明原因的CAKUT胎儿的致病性检出率,再次证明了CAKUT与单基因缺陷有相关性,尤其是合并其他异常的病例。为重复生育致死性CAKUT胎儿的家庭提供胚胎移植前诊断的可能性。2、有助指导孕期护理、评估胎儿的预后以及决定终止妊娠的时机。3、偶然发现一定程度上预防了很多疾病的发生,但也增加了成本支出。因此,建议遗传学委员会致力于探讨偶然发现对临床医生、患者/家属以及广大人群所造成的影响以进一步制定合理的方案。4、本研究在肾脏回声增强的胎儿中检测到致病性突变,但样本量太少,尚不能确定WES在孤立性肾脏回声增强胎儿中的应用价值。5、家系分析不仅能提高致病性检出率,还能大大的减少一代测序验证的成本以及在新的致病候选基因上鉴定出少量的突变。6、家系分析能加快WES分析的速度,缩短周转时间。因此,尽管成本较高,但还是建议使用该分析模式,尤其在产前诊断中。