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目的:
肺癌是临床常见的难治恶性肿瘤之一,是世界上癌症相关死亡的首要原因。在中国,每年新发肺癌病人数近60万人,是发病率第一的肿瘤,并且这一数字仍以每年4%的速度递增。临床上将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种类型,其中非小细胞肺癌是最常见的病理类型。标准的肺癌的治疗主要以手术治疗为主,化学治疗,放射治疗等手段为辅的综合治疗。但是,不是所有的患者都受益于常规的标准治疗,肺癌患者的5年生存率仍然很低。因此,探寻新的肺癌相关基因并探讨其在肺癌发生、发展中的作用机制,寻找潜在的靶向治疗基因对于发现肺癌新的治疗方法有着重要的意义。
PRKACB基因位于常染色体1p31.1上,编码PKA的催化亚单位β。PRKACB蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一,该蛋白的表达具有组织特异性,多位于细胞浆,是PKA活性的重要构成,作为cAMP/PKA细胞级联信号转导途径的重要分子,活化的PRKACB能够传递细胞外的刺激信号,参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡和基因转录等调节,与肿瘤生长及转移等生理病理过程有密切关系,如激活的PKA可通过对Raf-1活性的抑制进而阻断异常的信号通路Ras/Raf-1/MEK/MAPK的活性来抑制肿瘤生长。因此,我们首先检测PRKACB在人非小细胞肺癌组织及癌旁肺组织中的表达情况,并结合临床资料分析其与病理特征之间的关系;然后进一步构建PRKACB基因的正义表达载体,通过载体将目的基因转染入肺腺癌细胞株LTEP-a-2,筛选出PRKACB显著上调的稳定转染细胞株;研究PRKACB基因对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡以及侵袭等能力的影响,并进一步探讨其可能的作用机制。
方法:
应用Real Time PCR方法、免疫组织化学法和Western blot方法检测人非小细胞肺癌组织及癌旁肺组织中PRKACB的表达情况。根据PRKACB基因的序列,设计全长引物,提取肺腺癌细胞株LTEP-a-2的总RNA,通过逆转录反应获得cDNA。将PRKACB基因的eDNA插入携带绿色荧光蛋白报告基因的载体pEGFP-C1,形成重组载体pEGFP-C1-PRKACB,扩增后提取重组质粒pEGFP-C1-PRKACB,进行酶切、电泳及DNA测序鉴定。
肺腺癌细胞株LTEP-a-2,在含10%胎牛血清的1640完全培养液中,37℃和5%CO2条件下培养。采用Lipofectamine LTX&PLUS将载体pEGFP-C1-PRKACB转染入非小细胞肺癌细胞中。转染48小时后,应用RT-PCR及Westem blot方法检测转染后PRKACB的mRNA及蛋白水平表达,并以G418(400μg/ml)对pEGFP-C1-PRKACB及pEGFP-C1转染的LTEP-a-2细胞进行阳性克隆筛选,筛选出PRKACB基因正义表达的稳定转染细胞株及空载pEGFP-C1稳定转染细胞株。MTT和细胞平板克隆形成实验检测细胞增殖及克隆形成能力,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡水平的改变,Transwell小室检测细胞的迁移及侵袭能力。Western blot方法检测相关信号通路p-RAF-1(Ser43,259),RAF-1,p-ERK1/2和ERK1/2的表达水平。
结果:
Real Time PCR方法、免疫组织化学法和Western blot方法检测发现,非小细胞肺癌组织中PRKACB的mRNA和蛋白表达水平均明显低于癌旁肺组织,差异具有显著性;PRKACB的蛋白表达水平与患者的临床分期及淋巴结转移相关。
经酶切和DNA测序验证,证实pEGFP-C1-PRKACB表达载体构建成功。转染pEGFP-C1-PRKACB后的LTEP-a-2细胞荧光显微镜下可见绿色荧光。在转染pEGFP-C1-PRKACB组细胞中PRKACB表达水平较转染pEGFP-C1组和对照组LTEP-a-2细胞明显增强,故确认重组载体pEGFP-C1-PRKACB已成功转染至LTEP-a-2细胞中并起到了上调PRKACB基因表达的目的。通过G418进一步筛选,获得了稳定转染pEGFP-C1-PRKACB及空载pEGFP-C1的两组非小细胞肺癌细胞株,稳定转染pEGFP-C1-PRKACB的细胞中PRKACB表达水平明显高于稳定转染pEGFP-C1组和对照组细胞。
MTT实验和平板克隆形成实验提示,稳定转染pEGFP-C1-PRKACB的LTEP-a-2细胞与转染pEGFP-C1组细胞和对照组细胞相比增殖和克隆形成能力受到明显抑制,转染pEGFP-C1后细胞的增殖和克隆程度与对照组细胞相比则无明显改变。检测细胞周期分布发现,转染pEGFP-C1-PRKACB组细胞G2/M期细胞比例较转染pEGFP-C1组细胞和对照组细胞明显增高,而转染pEGFP-C1组细胞较对照组细胞无明显改变。检测细胞凋亡水平发现,转染pEGFP-C1-PRKACB后凋亡的细胞数较转染pEGFP-C1组和对照组的细胞数明显增多,转染pEGFP-C1组凋亡细胞数较对照组凋亡细胞数则无明显改变。Transwell迁移及侵袭实验发现转染pEGFP-C1-PRKACB后的LTEP-a-2细胞穿膜细胞数较转染pEGFP-C1组细胞和对照组细胞明显减少,而转染pEGFP-C1组细胞和对照组细胞相比穿膜细胞数无明显改变。Western blot结果显示,与对照组和转染pEGFP-C1组细胞相比,稳定转染pEGFP-C1-PRKACB组细胞中PRKACB的表达和p-RAF-1(Ser43,259)磷酸化水平的表达显著上调,p-ERK1/2磷化水平的表达显著下调,而RAF-1和ERK1/2的表达水平无明显变化。
结论:
1、PRKACB在非小细胞肺癌组织内呈现低表达,并与患者的临床分期及淋巴结转移相关,提示PRKACB的表达下调可能与非小细胞肺癌的发生及进展过程相关。
2、成功构建了携带绿色荧光且可用于稳定转染的pEGFP-C1-PRKACB正义表达载体,并筛选出稳定转染pEGFP-C1-PRKACB及空载pEGFP-C1的两组非小细胞肺癌细胞株,这将为今后应用PRKACB基因上调的表达载体研究PRKACB基因的作用机制提供实验基础。
3、上调PRKACB基因的表达,能明显抑制非小细胞肺癌细胞增殖及克隆能力,调控细胞周期分布,诱导细胞凋亡并降低细胞迁移及侵袭能力。
4、p-RAF-1(Ser43,259)的磷酸化表达水平上调及p-ERK1/2的磷酸化表达水平下调可能是PRKACB抗肿瘤影响的机制之一。