第一部分乳腺癌分子分型与超声征象相关性的研究研究背景乳腺癌作为全世界女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,严重威胁女性健康,早期筛查是乳腺癌预防和治疗的关键。超声检查作为乳腺癌筛查及诊断的常用方法,在乳腺癌的诊断中起不可或缺的作用。近年来,乳腺癌分子分型常用来预测乳腺癌的复发转移风险及进行疗效预判,研究乳腺癌的分子分型对于指导治疗有重要意义。乳腺癌的分子类型决定了其生物学行为和组织病理特点,进而影响其超声表现。因此若能术前通过超声对乳腺癌的分子类型进行初步判定,则可能对乳腺癌治疗方案的制定起一定的指导作用。对不同分子类型乳腺癌的超声征象的研究也能加深超声诊断医师对乳腺癌超声征象的理解。往有关于乳腺癌的ER、PR、HER2表达与超声征象的相关性的报道,但没有对乳腺癌进行具体的分子分型;有的学者对乳腺癌进行了分子分型,但依据的是旧的分型标准,没有将Ki67作为分型依据或没有强调PR表达的关键性。本部分研究依据新的分型标准对乳腺癌进行分子分型,回顾性分析了不同分子类型乳腺癌的超声表现,目的在于探讨乳腺癌的分子分型与超声征象的相关性,为通过超声判断乳腺癌的分子类型提供理论依据。研究目的依据新的分型标准对乳腺癌进行分子分型,研究乳腺癌的分子分型与超声征象的相关性。研究方法收集288例在山东省千佛山医院经手术病理证实的乳腺癌患者,根据其ER、PR、HER2及Ki67的免疫组织化学结果分为六型:LA型、LB(HER2-,PR+,Ki67≥14%)型、LB(HER2-,PR-,任何Ki67)型、LB-HER2+型、HER2+型、三阴性型。回顾性分析每位患者的超声图像,包括肿块大小(<2cm/≥2cm)、形状(圆形或椭圆形/不规则形)、方位(平行/垂直)、边缘(光整/模糊/成角/微小分叶/毛刺状)、周围高回声晕(无/有)、后方回声特征(无变化/增强/衰减/混合性改变)、微钙化(无/有)、Alder血流半定量分级(<Ⅱ级/≥Ⅱ级)、淋巴结转移(无/有),比较各型乳腺癌之间不同超声征象出现率的差异。计量资料采用单因素方差分析统计,计数资料采用卡方检验及Fisher确切概率法统计,检验水准P<0.05。研究结果各分型乳腺癌患者的年龄无统计学差异。LA型和LB(HER2-,PR+,Ki67≥14%)型Ki67≥14%的比例分别为0和100%,此两组不参与Ki67 的统计。LB(HER2-,PR-,任何 Ki67)型、LB-HER2+型、HER2+型及三阴性乳腺癌Ki67≥14%的比例分别为38.4%、65%、84%、78.6%,四组之间相比差异有统计学意义。超声图像分析发现各分子类型乳腺癌在肿块大小、形状、边缘、周边高回声晕、后方回声特征、微钙化和淋巴结转移方面差异有统计学意义,在肿块方位及Alder血流分级方面差异没有统计学意义。组内差异具体描述如下:(1)在肿块大小方面,LA型肿块大小≥2cm的比例最低,与其它各型之间相比差异均有统计学意义。(2)在肿块形状方面,三阴性乳腺癌表现为圆形或椭圆形的比例最高,与LB(HER2-,PR+,Ki67≥ 14%)型、LB(HER2-,PR-,任何 Ki67)型、LB-HER2+型相比分别有统计学差异。(3)在边缘特征方面,HER2+型乳腺癌边缘毛刺征的出现率最低,与LA型、LB(HER2-,PR+,Ki67≥14%)型、LB-HER2+型相比均有统计学意义。(4)周边高回声晕在HER2+型和三阴性乳腺癌的存在率较低。周边高回声晕的存在率在LA型、LB(HER2-,PR+,Ki67≥14%)型与HER2+型之间及LB(HER2-,PR+,Ki67≥14%)与三阴性乳腺癌之间分别有统计学差异。(5)在后方回声特征方面,LA型与LB(HER2-,PR+,Ki67≥14%)型、LB(HER2-,PR-,任何Ki67)型、HER2+型之间分别有统计学差异,LA型后方回声衰减的比例高于其他型,LB(HER2-,PR+,Ki67≥14%)型、LB(HER2-,PR-,任何Ki67)型和HER2+型后方回声增强的比例高于LA型;三阴性乳腺癌后方回声增强的比例最高,与其余型乳腺癌之间相比均有统计学差异。(6)在微钙化方面,三阴性乳腺癌微钙化的出现率最低,与LB(HER2-,PR+,Ki67≥14%)型、LB-HER2+型、HER2+型之间分别有统计学差异。HER2+型微钙化的出现率最高,与LA型及LB(HER2-,PR-,任何Ki67)相比有统计学意义。(7)在淋巴结转移方面,LA型淋巴结转移的比例最低,与LB(HER2-,PR-,任何Ki67)型、LB-HER2+型、三阴性乳腺癌之间有统计学差异;LB(HER2-,PR-,任何Ki67)淋巴结转移的比例最高,与LA型及LB(HER2-,PR+,Ki67≥14%)型相比有统计学差异。结论1.乳腺癌的分子分型与超声征象存在相关性。2.Ki67表达水平与乳腺癌的大小及后方回声增强相关。PR阴性与后方回声增强及淋巴结转移相关。Ki67水平和PR阴性分别对乳腺癌的超声征象有独立的影响。第二部分PAD 12参与乳腺癌发病的研究研究背景肽基精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine deiminase,PAD)是一种翻译后修饰酶,在Ca2+存在的条件下能将蛋白质多肽链中的精氨酸亚基脱亚氨基生成瓜氨酸,进而改变多种靶蛋白的结构和活性,导致其生理和生化活性的改变。早期研究发现,PADs在细胞分化和凋亡、神经生长、胚胎发育、基因调控等多种生理过程中发挥重要功能。PAD家族包括5个成员,分别为PADI1、PADI2、PADI3、PADI4和PADI6。各成员之间在组织分布和功能方面有明显差异。作为PAD家族重要成员,PADI2在人体多种组织中表达,最近研究发现,PADI2参与结肠癌、自发性皮肤癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌等多种肿瘤的发生,但其具体作用机制仍不清楚。为了深入研究PADI2参与肿瘤发生的分子机制,我们初步探索了 PADI2在乳腺癌中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),进一步研究了 PADI2对乳腺癌肿瘤细胞行为的影响,并通过PCRArray深入研究了 PADI2在乳腺癌发生中的调控机制。研究目的研究PADI2的SNP与肿瘤发病风险的相关性;PADI2对乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响;PCR array深入研究PADI2在乳腺癌发生中的作用机制。研究方法1.PADI2的SNP与肿瘤发病风险的相关性实验采用SequenomMassARRAY基因型分析法和TaqMan探针基因型分析法。实验所用样本均来源于齐鲁石化总医院(中国,山东,淄博)临床实验室,实验对象分为2组:病例组为经病理检查证实的恶性肿瘤患者;对照组为来自健康查体科的健康人群。所需样本为采集外周静脉全血2ml。利用Haploview4.2软件,通过搜索HapMap数据库寻找PADI2基因座的Tag SNPs。在PADI2的基因编码区找到了 4 个 Tag SNPs,包括 rs2746533、rs79395834、rs2076616 和rs10788656。随后用SequenomMassARRAY基因型分析方法检测以上4个Tag SNPs在病例组和对照组的等位基因频率和基因型频率。SequenomMassARRAY基因型分析的步骤包括:提取样本DNA、PCR扩增反应、PCR产物的碱性磷酸酶处理、单碱基延伸反应、树脂纯化、芯片点样、质谱检测等。SequenomMassARRAY基因型分析方法结果显示rs10788656位点的等位基因频率和基因型频率与多种肿瘤发病的相关性最强。随后我们在新的样本用TaqMan探针基因型分析法对rs10788656位点与多种肿瘤发病风险的相关性进行了验证。步骤包括提取用于TaqMan基因型分析的样本DNA,在96孔板中加入正向引物、反向引物、SNP分型探针及Master Mix试剂,进行PCR反应,应用在线软件分析结果。2.PADI2对乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响培养MCF7细胞,加入抗PADI2siRNA抑制PADI2表达,荧光定量PCR检测抑制效率,确定抑制效率在4倍以上,分别用CCK-8细胞增殖实验、流式细胞技术、Transwell小室迁移实验检测抑制PADI2表达对乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响。3.PCR array研究PADI2在乳腺癌发生中的作用机制培养MCF7乳腺癌细胞,加入抗PADI2siRNA抑制其PADI2的表达,同时设立阴性对照组和空白对照组。48h后荧光定量PCR检测抑制效率。将抑制效率在 4 倍以上的 cDNA 用于 the Cancer PathwayFinder PCR array 和 Signal Transduction Pathway PCR array分析。检出与阴性对照组相比表达改变在4倍以上的基因。合成检出基因的引物,用荧光定量PCR验证PCR array检出结果。研究结果1.SequenomMassARRAY基因型分析结果显示PADI2基因的rs10788656位点在如下各组与对照组之间的SNP差异有统计学意义:乳腺癌患者和对照组之间的基因型频率、宫颈癌患者和对照组的等位基因频率、食管癌患者和对照组之间的等位基因频率和基因型频率、肺癌患者与对照组之间的等位基因频率、直肠癌患者和对照组之间的基因型频率。rs2746533位点的等位基因频率和基因型频率在胃癌患者和对照组之间有明显差异。rs2076616位点的基因型频率在胃癌患者和对照组之间有明显差异。rs79395834位点在所检测病例中没有明显的SNP差异。TaqMan探针基因型分析法显示rs1 0788656位点在乳腺癌患者与对照组之间的等位基因频率和基因型频率存在差异。基因型分析没有检测出rs10788656在结肠癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、肝癌和直肠癌患者和对照组之间的差异。2.用抗PADI2 siRNA抑制MCF7的PADI2表达后,乳腺癌细胞迁移能力明显下降,细胞的增殖和凋亡没有明显变化。3.荧光定量PCR结果显示经抗PADI2 siRNA处理后,PADI2 mRNA表达明显被抑制。TheCancerPathwayfinderPCRarray检测出9个基因的表达发生明显变化,包括 ACSL4,BIRC3,CA9,CCL2,FLT1,FOXC2,G6PD,IGFBP3 和SNAI2。The Signal Transduction PCR array检测出16个基因的表达发生明显变化,包括 CA9,HEY2,ACSL4,ACSL5,BCL2A1,BIRC3,CEBPD,CSF1,FABP1,FOSL1,HES5,ICAM1,TNF,WNT3A 和 WNT6。通过荧光定量 PCR 对 PCR array检出结果进行验证,最终确定抗PADI2 siRNA处理的MCF-7细胞CA9表达上调、BIRC3和ACSL4表达下调,差异有统计学意义。其余经PCRarray检出的基因未得到荧光定量PCR的验证。结论1.PADI2是乳腺癌的易感基因。2.PADI2表达与乳腺癌细胞的异常迁移有关。3.PADI2可能通过ACSL4、BIRC3和CA9通路参与了乳腺癌的发病。