目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种老年人常见的神经系统退行性疾病,其主要临床症状表现为运动性症状如震颤、肌肉僵直、运动迟缓及非运动性症状包括感觉障碍、精神障碍、自主神经功能障碍和认知功能障碍等。非运动性障碍相对于运动性障碍发病率更高,病理机制更复杂,且可能出现得比运动症状更早。PD患者头部普通磁共振检查通常表现正常,实验室检查指标亦暂未发现非常特异的神经生物学标志物。关于PD的发病机制尚不清楚,目前认为可能与遗传、环境、感染、衰老、氧化应激、自由基过多形成、神经营养因子缺乏、甚至肠道菌群失调等有关,是多种机制协同作用的结果,泛素-蛋白酶体损害可能是这些不同因素的共同作用途径。应用质子磁共振波谱(1H-MRS),不少研究使用3T磁共振观察到了代谢物的变化,但在更高场强的磁共振7T\9T中并不多见,且结果不尽相同。本课题将紧跟神经外科、神经生物学和神经影像学研究的前沿,利用立体定向技术将注射于大鼠黑质纹状体通路制作PD模型,在不同时段观察其运动学症状及以记忆为代表的非运动学症状的改变,应用免疫组化和透射电镜确定病理学改变,通过超高场强核磁共振检查评估PD随着病程发展不同时期黑质纹状体通路和海马区域代谢的改变,通过综合研究,揭示超高场强磁共振检查提供不同病程PD神经代谢的生物学标志物的可能性,为影像学发现PD神经生物学标志物的可能性及高场磁共振下一步的临床应用提供理论基础。方法:本研究利用立体定向技术注射10ug/ul蛋白酶体抑制剂Lactacystin到SD大鼠的单侧黑质致密部,用阿扑吗啡诱发的健侧旋转实验筛选成功模型,连续1w、2w、3w观察大鼠的一般行为学改变,如震颤、活动迟缓、抓握、嗅探等异常行为,开野实验观察运动活跃性的指标和反映不对称运动行为的指标。反映运动活跃性的指标有:总跑动时间;总停息时间;直立次数;穿梭距离。反映不对称运动的指标包括旋转1/4弧度的次数;直立时前肢倚靠箱壁的次数;大鼠靠近箱壁探究活动的次数。Morris水迷宫测定动物的空间搜索能力和学习记忆能力;采用免疫组织化学、透射电镜观察PD大鼠不同病程中改变;为了探讨不同病程帕金森病模型纹状体局部脑组织代谢情况,利用9.4T高场磁共振根据脑组织氢质子频谱位移图,核磁共振频谱仪探测出各种常规的代谢物,根据以往的实验结果和各代谢物相应的位移峰,定位并观察并记录各组大鼠双侧纹状体局部脑组织N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate,2.00ppm),胆碱(choline,3.21ppm),肌醇(creatine,3.02 ppm),牛磺酸(taurine,3.42ppm)四种代谢物在不同时间段的变化趋势。利用9.4T高场磁共振观察Lactacystin诱导PD模型伴有学习记忆障碍的大鼠双侧海马局部脑组织N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate,2.00ppm),胆碱(choline,3.21ppm),肌醇(creatine,3.02 ppm),牛磺酸(taurine,3.42ppm)四种代谢物的水平。所有数据均以均数土标准差(X土S)表示,使用SPSS17.0统计分析软件进行数据分析,两组数据间比较釆用两组独立样本资料的t检验,不符合参数检验应用条件的数据采用非参数检验。差异显著性检验用重复资料的方差分析,两两比较釆用Student-Newman-Keuls检验。P<0.05认为有统计学差异。结果:立体定向技术注射10ug/ul蛋白酶体抑制剂Lactacystin到大鼠的单侧黑质致密部可以成功制作出PD大鼠模型,Lactacysin注射组4w组阿扑吗啡诱导30分钟内旋转圈数达到266.92±9.19。开野实验中Lactacystin诱导PD模型组大鼠跑动缓慢、动作频率明显减少,总跑动时间和穿梭距离均显著低于生理盐水对照组大鼠,反映不对称行为的指标中,Lactacystin诱导PD模型组偏侧性不对称行为明显多于生理盐水对照组。Lactacystin诱导成功的PD模型组大鼠组沿墙壁寻找的时间长,潜伏期亦明显延长,搜索方式带有明显的随意性,经过2—3天反复训练以后大多成为趋向式,但不稳定,而且也并不是一次的4个trail潜伏期递减,也并不是训练后期潜伏期就比训练前期潜伏期明显缩短,说明PD模型组大鼠能学习记忆部分受损,且记忆维持的时间较短暂而不稳定。生理盐水对照组大鼠在训练后潜伏期递减,说明对照组大鼠通过适应环境和几次训练后能很快学会搜寻目标平台,经常是以最直接的方式在最短的时间内找到平台。结果显示,生理盐水对照组潜伏期与PD一月组、PD三月组均有差异显著性,(P<0.01)。PD模型一月组大鼠及PD模型三月组大鼠也能够在120s内定位并爬上平台,但两组潜伏期亦有差异显著性(P=0.003<0.05).生理盐水对照组大鼠目标象限占比与其他三个象限有差异显著性(F=4.965,P=0.001<0.05)。Lactacystin诱导成功的PD模型一月组和三月组各象限占比之间无差异显著性(P=0.504>0.05)。说明帕金森病模型组空间学习记忆均有障碍。生理盐水对照组大鼠黑质致密部TH免疫阳性神经元计数左右侧分别为687.97±19.78和693.66±29.20,两者无统计学差异(P>0.05)。Lactacystin诱导PD组大鼠黑质致密部左侧及右侧TH免疫阳性神经元计数分别为134.50±29.04和685.50±19.33,两者比较有统计学差异(p<0.01),模型组左侧黑质致密部TH免疫阳性神经元计数均值较右侧减少了81%。三组SD大鼠在给药1周、2周和4周后接受活体9.4T MRI扫描观察双侧纹状体局部脑组织代谢水平:NAA代谢水平:(1)PD模型组与对照组比较,右侧黑质和生理盐水对照组之间无显著性差异(2)PD模型组自身比较,左侧黑质与右侧黑质比较,有显著性差异(P<0.01);(3)不同时间段之间比较,左侧黑质PD 2w组较PD1w组有上升,但到4w时恢复到与右侧和对照组相近的水平。三组均值上,1w和2w均小于4w,但1w和2w间差异无统计学意义。CHO代谢水平:(1)PD模型组与对照组比较,左侧黑质和生理盐水对照组之间有显著性差异(P<0.01)(2)PD模型组自身比较,左侧黑质与右侧黑质比较,有显著性差异(P<0.01);(3)PD模型组不同时间段之间比较,左侧黑质PD 2w组较PD1w组有上升,但到4w又下降至1w时的水平。三组均值上,两两之间差异均有统计学意义。1w大于2w,2w大于4w,均有统计学意义(P<0.01)。Cr代谢水平:(1)PD模型左侧组与生理盐水对照组比较,PD模型左侧组Cr代谢水平明显高于生理盐水对照组,有显著性差异(P<0.01)(2)PD模型组自身比较,左侧黑质与右侧黑质比较,左侧黑质Cr代谢水平明显高于右侧黑质,有显著性差异(P<0.01);(3)不同时间段之间比较,PD左侧黑质1w Cr代谢水平与2w比较,1w组水平明显低于2w,有显著性差异(P<0.01)。三组均值上,2w Cr代谢水平与4w比较,无显著性差异。Taurine代谢水平:(1)PD模型左侧组与生理盐水对照组比较,PD模型左侧组Taurine代谢水平明显低于生理盐水对照组,有显著性差异(P<0.01),PD模型右侧组与生理盐水对照组比较无统计学差异(2)不同时间段之间比较,PD左侧黑质1wTaurine代谢水平与2w比较,1w组水平明显高于2w,有显著性差异(P<0.01)。2wTaurine代谢水平与4w比较,2w组水平明显高于4w,有显著性差异(P<0.01)。观察Lactacystin注射制作的帕金森病模型伴和不伴有学习记忆障碍的大鼠海马CA1区脑组织代谢水平:伴有记忆障碍组NAA代谢水平:左侧海马与右侧海马比较,有显著性差异(P<0.01);CHO代谢水平:左侧海马与右侧海马比较,有显著性差异(P<0.01);Cr代谢水平:左侧海马与右侧海马比较,无显著性差异(P>0.01);Taurine代谢水平:左侧海马与右侧海马比较,有显著性差异(P<0.01);不伴有记忆障碍组NAA代谢水平:左侧海马与右侧海马比较,无显著性差异(P>0.01);CHO代谢水平:左侧海马与右侧海马比较,有显著性差异(P<0.01);Cr代谢水平:左侧海马与右侧海马比较,无显著性差异(P<0.01);Taurine代谢水平:左侧海马与右侧海马比较,无显著性差异(P>0.01);结论1.通过立体定向技术注射10ug/ul蛋白酶体抑制剂Lactacystin到大鼠的单侧黑质致密部可以成功制作出PD大鼠模型,此模型可以表现出与以往PD大鼠模型类似的阿扑吗啡诱发的单侧旋转表现。2.本实验制作的PD模型在神经病理学表现上与人类PD患者更相符,表现为毁损侧纹状体通路DA神经元大量丢失和残存的神经元中存在包涵体。我们认为其可以用于PD临床表现、发病机制及观察疗效的科学研究。3.在单靶点单次Lactacystin注射制作的帕金森旋转模型中,空间学习及空间工作记忆均有障碍。空间学习障碍随病程的延长逐渐加深,空间工作记忆障碍则无此种变化趋势。4.利用9.4T核磁共振观察单靶点单Lactacystin注射制作的帕金森病模型大鼠不同病程中黑质纹状体代谢产物的变化可以发现,在发病早期,NAA呈短暂升高趋势,随着病程的延长又逐渐下降,Cho\Cr呈升高趋势,Taurine呈明显的下降趋势。9.4T核磁共振是反复无创观察帕金森病模型大鼠局部脑组织代谢水平的理想方法。5.在单靶点单次Lactacystin注射制作的帕金森病模型伴有学习记忆障碍的大鼠中,观察到海马CA1区NAA、Cho呈升高趋势,Taurine呈明显的下降趋势。