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应用生活于淡水的克氏原螯虾（Cambrus proclakii，简称螯虾）作为动物模型，研究对虾白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV前称无包埋体对虾病毒，NOSV）在动物体内的增殖特性和机理，同时测定分析WSSV基因组片段序列，并将其中的一个阅读框进行了克隆和初步表达。 1．将对虾白斑综合征病毒（WSSV）接种螯虾，研究其感染增殖特性，涉及感染温度、感染途径、继发感染、半数致死量、免疫保护及保存期等。结果显示病毒增殖随温度升高而加快，温度降低对病毒增殖影响较显著。腹节肌肉、腹节皮下注射及口服WSSV均能使螯虾感染发病，而浸泡WSSV不能使螯虾发病。在螯虾感染后期，螯虾肝胰腺和心脏内的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）大量增殖，形成继发感染。WSSV对螯虾的LD50为10-6.5/ml病毒液。灭活病毒免疫螯虾不能使螯虾形成免疫保护。病毒在整体螯虾冻存较匀浆液优越，保存1年后仍有活力。 2．以螯虾为动物模型，检测药物和消毒剂对WSSV的作用，结果显示，用不同浓度的两种抗病毒药物浸泡螯虾后，螯虾死亡时间较对照组平均延长1.2～2d，其中的一种中药制剂较另一种药物略胜一筹。同时将WSSV分别用两类消毒剂37℃作用10min，再感染螯虾，结果表明，两者能抑制病毒活性，但未能有效灭活病毒。 3．制备WSSV单克隆抗体，建立单抗介导ELISA，同时制备WSSV基因探针，用于DOt-blot检测。从WSSV感染螯虾中提纯病毒，纯化病毒免疫BalB/C小鼠，采用细胞融合法获得4株杂交瘤细胞，四株单抗均属IgM。其中一株4E5在免疫转印中与37.5K左右的病毒条带呈阳性反应，用此株单抗作一抗，建立检测病毒蛋白的间接ELISA法，该方法能检测出感染组织中的病毒，而正常螯虾组织呈阴性。从重组质粒pAFD中回收WSSV 400bp大小基因组片段，用地高辛标记后制备探针，作DOt-blot，能灵敏、特异地检出感染组织中的WSSV。单抗介导ELISA和Dot-blot检测结果具有较好的一致性，后者较前者灵敏。 南京农业大学 博土学位论文 4．苗虾口服、肌注感染WSSV青岛株，斑点杂交与单抗介导ELISA检测体内动态分布。口服和肌注螫虾在感染后12h，病毒首先在血淋巴中出现，然后从血淋巴中消失，但口服组整虾在感染后96h，大量病毒又在血淋巴中出现，并维持到12加；口服36h和肌注24h，病毒在兹虾心脏和肌肉中同时出现，然后呈总体递增分布：此外，病毒在螫虾肠上皮、卵巢、真皮和结缔组织也有不同程度分布。感染死亡螫虾各主要组织器官均可检出病毒，口服组真皮含毒量最高，肌注组肠上皮、鳃、真皮、卵巢含毒量较高，表明此时病毒已形成周身感染。 5．用自行分离的WSSV射阳株感染螫虾，用斑点杂交和单抗ELISA检测其动态分布，并与WSSV青岛株相比较。鳖虾在口服和肌注感染后12h，射阳株首先在血淋巴中检出，36h时在肠上皮、心脏、肌肉中同时出现，井呈总体递增分布。斑点杂交、单抗ELISA和电镜观察均可从死亡袒虾各主要组织器官检出病毒，显示死亡凿虾内病毒已形成周身！4染。椎测WSSV首先进入血淋巴，然后扩散到心脏、肌肉、肠上皮等组织器官并在其内增殖，继而再次释放到血淋巴，最终形成周身感染直至赘虾死亡。与WSSV青岛株在繁虾的体内动态大体相仿。 6．取WSSV基因组随机文库中一个大小约skb的克隆片段测序，DNA序列用 DNA Sfor软件进行分析，共发现 43个 100hp以上开放性阅读框架（Ony），其中一条链31个，互补链12个。用BLAST软件将43个Ony及其推导的氢基酸序列分别与GeneBank中核酸蛋白数据库序列进行同源性比较，结果无显著同源性。在此测序片段中，发现一个 sl obp阅读框架，其编码氢基酸序列与海栖热袍菌外膜蛋白具有24％的同源性，设计一对引物，扩增该阅读框，用T载体克隆，并按正确阅读框架连接到大肠杆菌表达载体pGEX－6P－l上。重组菌经IPTG诱导后，菌体SDS－PAGE显示有一个大小为56K的融合表达蛋白产生。