目的:α-防御素又名人中性粒细胞肽(HNP),是由数十个氨基酸残基组成的阳离子多肽,在哺乳动物中性粒细胞中含量丰富,具有广谱抗微生物和细胞毒活性,是机体天然免疫的重要介质。同时α-防御素-1在抗人类免疫缺陷病毒(HIV)方面具有重要作用,有希望成为治疗艾滋病的新方法。自然获取大量防御素比较困难,乳腺生物反应器的发展为解决这一难题提供了新的思路。本研究将人α-防御素-1(HNP-1)基因与山羊β-乳球蛋白(BLG)基因调控区序列融合,构建了HNP-1基因乳腺定位表达载体,为进一步研究HNP-1基因在转基因动物乳腺中的表达奠定了基础。 方法:从山羊和人外周血中提取基因组DNA,用PCR方法扩增所需的BLG及HNP-1目的基因片断,经双脱氧终止法进行DNA测序,证实基因序列无误后将两片断相融合并克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)构建乳腺定位表达载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1,将连接产物转化大肠杆菌DH5α后,挑出的阳性克隆提取质粒进行PCR扩增,酶切及测序鉴定确定为目标质粒。 结果:1.PCR方法从山羊和人外周血中获取了大小为880bp和865bp的基因扩增产物。2.对阳性质粒进行酶切鉴定,证实其酶切图谱与预期的相一致,表明BLGHNP-1和载体片段连接成功,并且连接方向正确。3.以筛选的阳性质粒为模板进行PCR扩增,该阳性克隆含有BLG HNP-1和BLG-HNP-1的DNA片段,并且嵌入方向是正确的。4.测序结果表明,该质粒上的BLG和HNP-1的基因序列无突变,连接方向正确,阅读框无移位,pcDNA3.1-BLG-HNP-1表达质粒构建成功。 结论:成功构建了HNP-1基因乳腺定位表达载体,为进一步研究HNP-1基因的高效表达奠定了基础。