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目的: Wilms瘤是一种实质性肿瘤多发于儿童,治疗方法通常为手术、化疗、放疗的联合治疗,通常情况下预后良好。然而,该肿瘤在经过一期治疗后会有10-15%的患者发生复发和转移,且出现复发和转移的患者中有将近30%的患者最终死亡。该病的致病机制尚不清楚。许多临床案例指出在Wilms瘤中能够检测到大量的Mutant p53,且有报道指出Mutant p53可以与Smad结合抑制p63进而促进TGFβ诱导的肿瘤细胞的转移。它还可以与其下游基因MLL1、MLL2相互作用促进肿瘤的生长,该机制为Gain-of-function,还可通过甲羟戊酸途径影响乳腺癌的进展,这可能预示着Mutant p53可能与Wilms瘤有关。在本研究中,我们旨在探讨Mutant p53及其下游基因对Wilms瘤发展转移的影响。 方法: (1)选取WiT49细胞作为Wilms瘤的细胞模型,常规培养与5%CO2培养箱中,每2天换一次液。通过细胞转染实验获得shegfp和shtp53的稳转株。其中shegfp为阴性对照组,shtp53为实验组。 (2)提取WiT49细胞的RNA进行QPCR实验检测tp53以及其相关靶基因的基因表达情况,结果没能出现预期的随Mutant p53敲低其下游靶基因下调的情况。(3)通过RNA-SEQ实验筛选出随Mutant p53的敲低而下调的下游基因,并对这些基因进行QPCR的验证。 (4)这些下调的下游基因中,Bche的P值<0.01,下调显著,所以极有可能是Mutant p53在Wilms瘤中的靶基因且在以往的文献报道中指出,有将近40%的肺鳞状细胞癌中能检测到大量的Bche,但也有文献指出在前列腺癌中,Bche的含量大大减少,这使我们想探究Bche在Wilms瘤中的具体影响。 (5)再次转染WiT4细胞,获得shgipz和shbche的稳转株,shgipz为阴性对照组,shbche为实验组,并通过QPCR实验验证基因的表达情况。 (6)通过MTT实验,Wound healing assy,克隆形成,Transwell实验进一步验证Mutant p53及其下游基因bche对Wilms瘤发展转移的作用。 结果: 1.QPCR实验显示,Mutant p53的靶基因没有随Mutant p53的敲低而下调。这些基因的对照vs shtp53组的2-△△CT的值分别为MLL1:1.07±0.09vs1.28±0.08ns P>0.05,MLL2:1.02±0.05vs1.14±0.1ns P>0.05,HMGCR:1.03±0.05vs1.79±0.1*P<0.05,MVK:1.1±0.16vs1.76±0.08*P<0.05,MVD:1.04±0.06vs0.91nsP>0.05,FDPS:1.04±0.06vs1.38±0.17nsP>0.05,SQLE:1.03±0.05vs3.86±0.14*P<0.05,LSS:1.04±0.06vs1.6±0.1*P<0.05,DHCR7:1.06±0.09vs3.36±0.1*P<0.05,SHARP1:1.07±0.1vs1.47±0.1nsP>0.05,CYCLIN G2:1.06±0.08vs1.04±0.1nsP>0.05。(结果中P<0.05的基因随Mutant p53的敲低而上调) 2.RNA-SEQ实验显示,CDH12,CXCL14,IGFBP5,UBE2L6,WNT5B,ADGRG6,BCHE,SOSTDC1,DSP,SLC22A17,CCND2,EFNA1,SATB1,SERPING1,DMXL2,SYT13,SLFN5,SEPP1,通过QPCR实验可知这18个基因随Mutant p53的敲低而下调并且P<0.05。 3.MTT实验显示,tp53和bche对Wlms瘤的细胞增殖没有明显影响。该实验分别在24h,48h,72h,96h测取吸光度值,并计算96h与24h吸光度的差值作为判断依据。对照组vs shtp53为0.87±0.03vs0.78±0.06,nsP>0.05;对照组vs shbche为0.638±0.01vs0.623±0.07,nsP>0.05。(n=5) 4.Wound healing assay实验显示,敲低bche能明显抑制Wilms瘤的细胞迁移能力,而敲低Mutant p53则对Wilms瘤的细胞迁移能力无明显的影响。分别在0h,24h,36h,48h对细胞进行拍照并进行最终的统计分析,并计算48h的划横宽度/0h的划横宽度的百分比作为判断依据。对照组vs sh bche组的9%±0.1vs22%±0.12并且**P<0.05(n=5);对照组vs shtp53为26%±0.09vs28±0.04,nsP>0.05。 5.克隆形成实验显示,bche稳转株的阴性对照组和实验组的细胞数无明显差异,说明Bche对Wilms瘤的成瘤能力无明显影响。形成的克隆数正常对照组vs shbche为8.7±1.5vs11.7±2.5,nsP>0.05。 6.Transwell实验显示,tp53和bche俩组稳转株的阴性对照组和实验组穿过的细胞数量无明显的差异,说明敲低tp53和bche对Wilms瘤的侵袭能力无明显影响。计算染色细胞的数量。正常对照组vs shp53为222±10vs192.5±7.5,nsP>0.05。正常对照组vs shbche为206±6vs199±10,nsP>0.05。 结论: 1.在Wilms瘤中Mutant p53对其增殖,迁移和侵袭没有明显的影响。. 2.在Wilms瘤中Bche对其增殖,成瘤,侵袭没有明显影响,但却能明显影响Wilms瘤的迁移能力,这说明Bche可能与Wilms瘤术后发生转移有关,有可能是重要的预后指标和潜在的治疗靶点。