甲壳素,又名几丁质(chitin),是自然界中含量仅次于纤维素的第二大天然多糖,主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳的外壳、真菌和植物的细胞壁中。甲壳素的分子链中分布许多羟基、氨基及乙酰氨基,形成大量分子间及分子内氢键,致使其结晶度较高,化学性质十分稳定,直接利用较为困难。离子液体对纤维素和甲壳素等生物大分子具有较强的溶解能力,因此可以利用离子液体预处理虾蟹壳,减弱分子内分子间氢键作用,再用甲壳素酶特异性水解甲壳素链中β-1,4糖苷键,得到水溶性的甲壳寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖。与工业上强酸强碱处理甲壳素制备壳寡糖类产品相比,该方法工艺简单、反应条件温和、环境友好,有很好的应用前景。本研究以Paenibacillus pasadenensis CS0611为出发菌株,蟹壳粉末作为培养基唯一碳源,在适宜条件下培养48 h。发酵液经离心、硫酸铵盐析、透析除盐后得到粗酶液;利用Hi Trap DEAE FF离子交换层析和HiLoad 26/600 Superdex 200pg凝胶过滤层析对该粗酶液进行分离纯化,以得到电泳纯甲壳素酶。所制备甲壳素酶比活力为10.28 U/mg,最终纯化倍数为5.30,酶活得率为15.70%。SDS-PAGE结果表明该甲壳素酶相对分子质量约为69.0 kDa。后经MALDI-TOF-MS鉴定,该酶部分肽段和来源于另一株Paenibacillus pasadenenss的甲壳素酶(accession No:gi655151624)具有较高的同源性,进一步证实所纯化蛋白为甲壳素酶。对上述纯化的甲壳素酶的酶学性质进行研究,结果发现:其最适反应温度为50°C,在20-35°C内有较好的稳定性,50°C以上热稳定性较差;最适pH为5.0,在pH 4.0-11.0间具有较高稳定性,表明该酶具有很好的耐碱性;检测的金属离子对该酶的催化活性没有明显的激活作用,表明该酶为非金属酶。同时,对该酶的底物特异性进行研究,发现该酶对胶体甲壳素和甲壳素水解能力较强,对淀粉和纤维素无水解能力,对不同脱乙酰度的壳聚糖的水解程度随脱乙酰度不同而变化,表明该酶只能特异性识别并降解GlcNAc-GlcNAc之间的糖苷键;以胶体甲壳素为底物时,米氏常数Km为4.41 mg/mL,最大反应初速度为1.08 mg/min,水解效率远高于甲壳素;利用薄板层析和高效液相色谱对酶解产物进行分析,结果表明该甲壳素酶对甲壳素的降解产物主要是(GlcNAc)2。在咪唑类离子液体中选择预处理效果最好的[BMIm]Ac,在最适条件100°C、1 h预处理蟹壳。甲壳素酶在35°C条件下水解重生的蟹壳7 h,产物含量最高达2.88 mg/mL,而胶体甲壳素产物含量只有0.86 mg/mL,产物经质谱鉴定为乙酰化壳二糖。经FTIR、XRD、SEM分析可知与胶体甲壳素结晶度降低不同,蟹壳经离子液体预处理后,发生脱乙酰作用,原有组织破坏,在水中分散性提高,利于与酶的接触,而结晶度并没有降低。本研究不仅丰富了甲壳素酶酶学基础理论知识,而且开辟了由蟹壳直接制备乙酰化壳二糖的新途径。