研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是五大常见癌症之一,每年影响了全世界约100万人。尽管在过去几十年中肝癌的诊断和治疗取得了巨大进步,但治疗效果仍不令人满意。越来越多的证据表明,肿瘤干细胞能够在化疗放疗等治疗手段中生存下来、无限繁殖并会分化为肿瘤细胞,与癌症患者疾病的复发、转移以及预后较差直接相关。也有许多证据表明了肝癌干细胞的存在,并且肝癌干细胞被认为是肝癌起始、转移、复发和化疗耐药的原因。维持肿瘤干细胞生长和自我更新能力的重要信号通路有JAK/STAT、Hedgehog、Wnt、Notch和NF-κB等。有研究报道,Wnt信号通路的失常与肝癌的发生发展有关,有40%-70%的HCC患者在早期能检测到β-catenin蛋白在细胞核的累积,这是Wnt/β-catenin信号通路活化的标志之一。然而,有关Wnt信号通路的研究大多是针对经典或非经典Wnt信号通路中的分子,比如Wnt3a、Wnt5a等,对于还没被鉴定信号通路类型的分子Wnt2b的研究较少。在之前的研究中,我们课题组发现Wnt2b在纤维化肝脏中高表达,并且能够抑制肝星状细胞的活化,发挥抗纤维化作用。肝纤维化的严重程度与肝癌患病率相关,Wnt2b发挥着抗纤维化作用,那么在肝癌中是否也发挥着一定的作用呢?因此,在本研究中我们通过分子生物学和细胞生物学等多种实验手段,利用体内外模型探究Wnt2b对肝癌细胞干性的影响。研究目的1.观察Wnt2b在肝癌细胞及肝癌组织中表达水平的变化;2.探究Wnt2b对肝癌细胞肿瘤生物学特征的影响并探讨其相关机制。研究方法1.应用实时荧光定量PCR对人正常肝细胞及常见肝癌细胞系中Wnt2b的表达情况进行检测;2.在二乙基亚硝胺联合四氯化碳(DEN/CCl4)诱导的小鼠肝癌模型中,利用实时荧光定量PCR检测肝癌组织中Wnt2b及AFP的表达水平;3.应用实时荧光定量PCR及Western blot验证过表达及敲低Wnt2b质粒的过表达及敲低效果;4.用过表达Wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞24 h后,利用实时荧光定量PCR检测细胞中炎症因子的mRNA水平;5.用过表达及敲低Wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞48 h后,将转染细胞以1000个细胞/每孔重新接入6孔板中,培养1-2周,观察细胞的克隆形成;6.用过表达及敲低Wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞48 h后,应用实时荧光定量PCR检测细胞中肝癌干细胞标志分子CD44、EpCAM、CD47、ICAM-1、CD133的mRNA水平,同时应用Western blot检测其中EpCAM的蛋白水平;7.用过表达及敲低Wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞48 h后,将转染细胞以5000个细胞/每孔重新接入超低粘附6孔板中,培养1-2周,观察细胞的肿瘤成球情况;8.用过表达及敲低Wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞48 h后,应用实时荧光定量PCR检测细胞中干细胞多能转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-myc、Nanog的mRNA水平,同时应用Western blot检测其中Sox2的蛋白水平;9.用敲低Wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞24 h后,利用实时荧光定量PCR检测细胞中药物转运蛋白MRP和MDP的mRNA表达水平;10.用敲低Wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞48 h后,将转染细胞以7000个细胞/每孔重新接入96孔板中,加入不同浓度的索拉菲尼(sorafenib)药液,2天后利用MTT法检测细胞的增殖能力;11.合成针对Wnt2b的shRNA序列,退火,经与酶切慢病毒载体pLKO.1连接、转化及测序等步骤,构建敲低Wnt2b的慢病毒载体;12.利用磷酸钙转染,将构建的敲低Wnt2b的慢病毒载体转染到293T细胞中,应用实时荧光定量PCR检测其敲低效果;13.慢病毒包装鼠源敲低Wnt2b载体,收集病毒上清,用其感染Hepal-6细胞,分别用107、106两个数量级的细胞进行皮下荷瘤,比较各数量级下小鼠的肿瘤发生率。研究结果1.Wnt2b在肝癌细胞及肝癌组织中高表达与正常肝细胞系HL-7702相比,肝癌细胞系SMMC-7721、BEL-7402、Huh7中Wnt2b的mRNA表达水平显著升高。在DEN/CCl4诱导的小鼠肝癌模型中,肝癌组织中的Wnt2b的表达水平与肝癌标记物甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)的表达水平是一致的。2.过表达及敲低Wnt2b的质粒是有效的在肝癌细胞Hepal-6中,转染过表达或敲低Wnt2b的质粒后,从mRNA和蛋白水平上检测了其效果,结果证明过表达Wnt2b后,细胞中Wnt2b的mRNA水平和蛋白水平是升高的;敲低Wnt2b后,细胞中Wnt2b的mRNA水平和蛋白水平是降低的。说明所构建的过表达质粒和敲低质粒的有效性。3.Wnt2b促进肝癌细胞的干性在肝癌细胞中,过表达Wnt2b后,与对照组相比,细胞的干性标志分子CD44、EpCAM、CD133的基因水平显著升高,EpCAM的蛋白水平显著增高;细胞的克隆形成能力,肿瘤成球能力比对照组强;细胞的多能转录因子Sox2、Klf4、c-myc、Nanog的基因水平显著升高,Sox2的蛋白水平显著升高;敲低Wnt2b后得到相反的实验结果。这些体外实验的结果都说明Wnt2b能够促进肝癌细胞的干性。4.敲低Wnt2b的慢病毒载体的构建及效果验证构建鼠源敲低Wnt2b慢病毒载体,构建完成后通过测序证明所构载体的准确性;将载体转染到293T细胞中,Wnt2b的基因水平显著降低,说明该载体成功敲低了Wnt2b的表达水平,证明了载体的有效性。5.Wnt2b的敲低抑制了肝癌细胞的肿瘤起始能力利用慢病毒包装及感染技术,获得能稳定低表达Wnt2b的肝癌细胞,用不同数量级低表达Wnt2b的肝癌细胞荷瘤,与对照组相比,发现敲低Wnt2b的细胞有着较低的肿瘤起始能力,说明敲低Wnt2b抑制了肝癌细胞的干性。结论及意义1.本研究发现,Wnt2b在人肝癌细胞系中高表达,并且高表达Wnt2b的肝癌患者有着较低的生存率;在小鼠肝癌组织中,Wnt2b与肝癌标记物AFP的表达水平一致。2.本研究发现Wnt2b能促进肝癌细胞表面干性标志分子表达的升高,并且还能促进肝癌细胞干性相关生物学特征,包括较强的集落形成能力、成球能力和肿瘤起始能力,以及对化疗药的耐受,证明Wnt2b能够促进肝癌细胞的干性。3.该研究为进一步探索肝癌发生发展的机制、建立有效治疗肝癌的新靶点和新策略奠定了基础。综上所述,本研究证明了 Wnt2b能够促进肝癌细胞的干性。研究提示,Wnt2b可能作为一种肝癌治疗的新靶点,通过靶向肝癌细胞中的Wnt2b,抑制它的合成或表达能够显著抑制肝癌干细胞的干性,能够有效解决癌症的耐药,复发及转移,为通过靶向肝癌干细胞来治疗肝癌提供了一个新的方向和实验依据。