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木食性白蚁是自然界木质纤维素的高效降解者,在全球碳循环中发挥着重要作用。白蚁降解木质纤维素的过程中,其肠道内的共生细菌发挥着重要的作用。高等白蚁和低等白蚁肠道内均有检测到疣微菌16S rRNA基因序列,但这类菌群在白蚁肠道生态环境内发挥的作用我们了解甚微。本论文以高等白蚁象白蚁Nasutitermes sp.和低等白蚁黑胸散白蚁为对象,分析了这两种白蚁肠道内共生疣微菌的多样性;初步研究了分离自黑胸散白蚁肠道的可培养疣微菌TSB-47菌株的理化特性和功能,对TSB-47基因组中三个β-葡萄糖苷酶基因GM1124、GM1951、GM3190进行了原核表达与重组酶的酶学特性分析,为进一步探究疣微菌与白蚁的共生机制奠定了基础。本论文的初步研究结果如下:1.高等白蚁象白蚁Nasutitermes sp.和低等白蚁黑胸散白蚁共生疣微菌的多样性分析以象白蚁Nasutitermes sp.和黑胸散白蚁为研究对象,分别构建了其共生疣微菌16S rRNA基因文库,从两种白蚁肠道内均得到了 6个疣微菌克隆序列。其中,象白蚁Nasutitermes sp.共生疣微菌的优势菌是Nver-1,占有的比例为53%,它与分离自美洲大蠊的Opitutus sp.PH5-10最相似,16S rRNA基因的相似性为96%;其次是Nver-32,占有的比例为17%,它与分离自黄肢散白蚁的TAV1 16S rRNA基因的相似性为97%;黑胸散白蚁的疣微菌克隆中,Rver-2所占的比例最高,为55%,它与本实验室从黑胸散白蚁分离的共生疣微菌TSB-47 16S rRNA基因的相似性达到了99%。系统发育分析表明,两种白蚁肠道内的共生疣微菌绝大部分是疣微菌门亚门4的成员,它们与其他白蚁肠道内的疣微菌亲缘关系最近,形成一个大的白蚁簇。少数疣微菌属于疣微菌门亚门1的成员,与其它环境的疣微菌形成一个独立的簇。2.疣微菌TSB-47特性的初步研究对分离自黑胸散白蚁的共生疣微菌TSB-47的理化特性进行了初步研究。TSB47是兼性厌氧菌,最适生长温度为25℃,最适生长pH为7.5,在0～2.5%NaCl浓度下可以生长。菌株TSB-47的主要脂肪酸为Anteiso C15:0(37.56%),C16:0(33.21%)和Anteiso C17:0(12.36%),呼吸醌类型为MK-7。能够利用葡萄糖和纤维二糖为唯一碳源生长,固氮活性研究表明TSB-47能在无氮AM-5培养基中生长,具有固氮活性。3.疣微菌TSB-47三个β-葡萄糖苷酶基因的原核表达与重组酶特性研究TSB-47基因组中共有14个p-葡萄糖苷酶基因。利用大肠杆菌系统克隆表达了其中3个基因,分别命名为GM1124、GM1951、GM3190。基因全长分别为1365 bp、2166 bp、1356 bp,目的蛋白的相对分子质量分别为51 KD、78.4 KD、50.5 KD。3个BG酶基因在大肠杆菌表达系统中均获得了可溶性目的蛋白,命名为GM1124-30a、GM1951-30a、GM3190-30a。经纯化的重组酶 GM1124-30a、GM1951-30a、GM3190-30a最适反应pH分别为5.0、6.0、5.5,最适反应温度为50℃、50℃和45℃;以pNPG为底物,测得最适反应条件下GM1124-30a、GM1951-30a、GM3190-30a 的比活力分别为2.55 U/mg、2.03 U/mg、8.8 U/mg。因GM3190-30a的比活力最大,后续实验中进一步探究GM3190-30a的其他酶学特性。以 pNPG 为底物时,GM3190-30a 的Km=23.4 mM,Vmax=13.7 umol min-1.mg-1。当金属离子浓度为1 mM时,Fe3+、A13+、Ni2+、Zn2+、Co+对GM3190-30a的酶活力有促进作用,Ba2+、Ca2+、Mn2+、K+对酶活力的影响不明显;当金属离子浓度为5 mM 时,Mg2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、K+、Co+对 3190-30a 蛋白有促进作用,而 Fe3+、Ni2+、Zn2+对重组酶表现出抑制作用;Cu2+在两种离子浓度下都能完全抑制该酶的活性。同时测定了不同浓度化合物对酶活力的影响。EDTA和丙酮对重组酶GM3190-30a有促进作用,但是伴随着化合物浓度的增加,促进作用会减弱;咪唑和甲醇对重组酶GM3190-30a有抑制作用,随着化合物浓度的增加,抑制作用会增强;低浓度的尿素对重组酶有抑制作用,而高浓度的尿素则对重组酶有促进作用;低浓度的异硫氰酸胍和乙醇对重组酶GM3190-30a有促进作用,但是高浓度的异硫氰酸胍和乙醇则对重组酶GM3190-30a有抑制作用;不同浓度的盐酸胍对重组酶GM3190-30a的作用不明显;SDS能使重组酶变性后完全失去活性。TLC的实验结果表明,GM3190-30a可以水解纤维二糖、纤维三糖。葡萄糖作为酶促反应的底物,对GM3190-30a具有反馈抑制作用,随着葡萄糖浓度的增加,抑制作用越明显。GM3190-30a表现出了一定的耐盐性,当NaCl和KC1的浓度达到4 M时,GM3190-30a的剩余酶活力超过40%。同时,在酶促反应中加入适量的盐离子,可以增强GM3190-30a的酶活力。