头颈鳞癌(Head and neck squamous cell carcimoma, HNSCC)是人体常见的恶性肿瘤,其生长速度快、侵袭力强,手术加放、化疗的综合治疗已成为其治疗的主要方法。头颈鳞癌对放化疗敏感度低、抵抗力强,一直是肿瘤治疗的一个难题。近年来肿瘤的基因治疗为肿瘤的治疗带来了新的机遇,尽管对癌基因及抑癌基因具体作用机制的认识尚有许多不足,但以癌基因及抑癌基因为突破口的基因治疗是肿瘤治疗中最根本、最有前途的方法之一。由于基因治疗具有不易产生耐药性、不受肿瘤细胞周期限制、特异性强及对原发肿瘤和转移瘤都有良好疗效等优点,因此基因治疗及其相关领域是近年来研究的热点。而其过程中的关键是靶点的研究,所以肿瘤信号传导通路的研究是其理论基础。细胞信号转导和调控异常与肿瘤的发生、发展密切相关。一些肿瘤信号传导通路集中于有限的几个核转录因子,成为导致细胞恶性转化的最终开关。新近发现的信号转导子和转录激活子3(signal transducer and Activetor of transcription 3, Stat3)信号通路在人类大量肿瘤中被持续激活并异常调节细胞,在人类恶性肿瘤的发生、发展和演进中起着重要作用。喉鳞癌中是否存在Stat3肿瘤信号传导通路,Stat3肿瘤信号传导通路是否参与了喉鳞癌的转化及发展,至今在国内外尚未见报道。为探讨Stat3信号通路在喉鳞癌发生发展和浸润转移中的分子机制,为喉癌的基因治疗筛选理想的靶目标,本研究在喉鳞癌组织和喉鳞癌细胞系Hep-2中利用免疫组化技术、Western Blot、MTT及流式细胞技术等方法探讨了喉鳞癌中Stat3信号通路的激活状态及其临床意义,从不同侧面了解Stat3与喉癌生物学行为和化疗抵抗关系及其机理。其中包括探讨喉癌组织中Stat3蛋白表达水平的临床意义,总结Stat3是否可作为喉癌早期诊断、术前辅助诊断和病情监测标记物;应用Stat3反义寡核苷酸技术转染人喉癌细胞系后,研究喉癌细胞增殖水平随时间延长和浓度的关系;喉癌细胞周期停滞Stat3蛋白表达与活性是否下调,与CyclinD1、CyclinE及CDK2、CDK4、CDK6蛋白表达的关系,G1期细胞和S期细胞的比率,探讨Stat3信号传导通路对喉癌细胞G1～S期调控的可能机制;利用干扰技术阻断喉鳞癌细胞中活化的Stat3信号通路后,探讨对喉鳞癌细胞增殖、凋亡的影响等及在减低喉癌化疗抵抗和增强其对化疗药物DDP敏感性的可能性。因此,Stat3信号传导通路与细胞周期调控的研究对于癌基因Stat3靶向性治疗肿瘤具有重要意义,探讨抑制Stat3生成在减低喉癌化疗抵抗和增强其对化疗敏感性的可能性为研究发现高效、低毒的抗癌药物及设计新的联合治疗方案提供理论和实验基础,本研究的完成对进一步探讨喉癌的发生、浸润、转移机制,揭示以Stat3信号转导通路为靶点在喉癌治疗中的作用和作用机制,增强头颈肿瘤患者的综合治疗效果和改善预后都具有较大理论和实际应用价值。本实验分为以下三部分:第一部分Stat3信号传导通路在喉癌中的组成性激活及其与喉鳞癌生物学行为的关系目的:观察JAK-Stat途径中Stat3、p-Stat3、Cyclin Dl与Bcl-xl蛋白在喉癌组织和喉癌细胞系中的表达及相互关系,探讨Stat3信号传导通路在喉癌中的组成性激活与喉癌患者临床病理特征之间的关系。方法1采用免疫组化SP技术检测50例喉鳞癌组织及其相应的癌旁正常喉黏膜组织和喉癌细胞系Hep-2中Stat3和磷酸化Stat3 (p-Stat3)蛋白的表达。2采用Western-blot技术检测50例喉鳞癌组织及其相应的癌旁正常喉黏膜组织和喉癌细胞系Hep-2中Stat3、p-Stat3蛋白及其下游靶基因产物Cyclin Dl、Bcl-xl蛋白的表达。结果1喉鳞癌组织中存在着组成性激活的Stat3信号1.1 Stat3蛋白的阳性表达信号在细胞浆和细胞核中均有表达。50例喉癌组织中Stat3蛋白表达阳性率为72%,对照组癌旁正常喉组织中Stat3蛋白的表达阳性率为44%,喉癌中Stat3蛋白的表达明显高于对照组(P<0.05)。1.2 p-Stat3蛋白为磷酸化的Stat3蛋白(即活化的Stat3蛋白),其表达的强度代表着Stat3信号的激活程度。其阳性染色主要定位于细胞核中。50例喉癌组织中p-Stat3的蛋白表达阳性率为58%(29例),对照组癌旁正常喉组织中无p-Stat3蛋白的表达,两组之间有显著性差异(P=0.000)。1.3 Western-blot结果显示,显示Stat3在癌组织中的表达量为86.9738±1.58576,在正常组织中为36.1033±0.52674,两者相比具有显著性差异(P=0.0000)。p-Stat3在癌组织中的表达量为56.9734±3.93939,在正常组织中为16.5233±0.52913,两者相比具有显著性差异(P=0.0000)。Cyclin Dl在癌组织中的表达量为24.4376±5.6231,在正常组织中为5.9435±1.7529,两者相比具有显著性差异(P=0.0001)。Bcl-xl在癌组织中的表达量为33.7834±3.5673,在正常组织中为14.6884±2.1485,两者相比具有显著性差异(P=0.0001)。喉癌标本组织中Stat3、p-Stat3、Cyclin Dl与Bcl-xl的蛋白表达水平明显高于癌旁喉粘膜,肿瘤组织表达量分别为癌旁粘膜的2.4、3.4、5.1、2.3倍。2 Stat3信号的表达与喉鳞癌临床病理学特征的关系2.1 Stat3在喉癌组织的表达与喉癌患者的年龄(P=0.716)、性别(P=0.853)、肿瘤部位(P=0.725)、T分期(P=0.751)无关;与临床分期(P=0.014)、病理分级(P=0.032)、淋巴结转移(P=0.025)有关。病理分级越低Stat3蛋白的阳性率越高(P=0.0169),临床分期越晚Stat3蛋白的阳性率越高(P=0.0056),有淋巴结转移的病例,Stat3蛋白的表达增强(P=0.0083)。2.2 p-Stat3在喉癌组织的表达与喉癌患者的年龄(P=0.875)、性别(P=0.816)、肿瘤部位(P=0.797)、T分期(P=0.6700)无关;与临床分期(P=0.026)、病理分级(P=0.019)、淋巴结转移(P=0.034)有关。病理分级越低p-Stat3蛋白的阳性率越高(P=0.0004);临床分期越晚p-Stat3蛋白的阳性率越高(P=0.0208),有淋巴结转移的病例,p-Stat3蛋白表达也增强(P=0.0144)。2.3 Cyclin Dl在喉癌组织的表达与喉癌患者的年龄(P=0.875)、性别(P=0.871)、肿瘤部位(P=0.889)、T分期(P=0.612)无关;与临床分期(P=0.015)、病理分级(P=0.027)、淋巴结转移(P=0.034)有关。2.4 Bcl-xl在喉癌组织的表达与喉癌患者的年龄(P=0.873)、性别(P=0.882)、肿瘤部位(P=0.923)、T分期(P=0.686)无关;与临床分期(P=0.023)、病理分级(P=0.038)、淋巴结转移(P=0.033)有关。3喉癌组织中p-Stat3与Cyclin Dl、Bcl-xl表达相关性及差异性分析经Pearson相关性分析显示,在喉癌组织中p-Stat3与Cyclin D1表达呈线性相关(r=0.437,P<0.05),而p-Stat3与Bcl-xl表达相关性无统计学意义(r=0 .146,p>0.05)。4喉癌细胞系Hep-2中存在着组成性激活的Stat3信号免疫细胞化学法和Western Blot检测结果表明,Stat3蛋白及p-Stat3蛋白在Hep-2细胞中均有表达。Stat3蛋白在Hep-2细胞系中主要位于细胞浆中,胞核中少有表达。p-Stat3蛋白主要定位于细胞核中,相对于Stat3的表达来讲,p-Stat3蛋白的表达程度较弱,表明Stat3信号在Hep-2细胞中存在着较高的激活程度;Stat3信号通路的下游靶基因Cyclin Dl、Bcl-xl蛋白在Hep-2细胞中也均有表达。5喉癌细胞系Hep-2中Stat3、p-Stat3与Cyclin Dl、Bcl-xl表达相关性Western Blot结果表明, Cyclin Dl表达变化趋势与Stat3同步,而Bcl-xl表达变化不明显。第二部分Stat3信号传导通路对喉癌细胞G1~S期的调控目的:应用Stat3反义寡核苷酸技术转染人喉癌细胞系后,研究喉癌细胞周期停滞对Stat3蛋白表达与活性的影响以及和CDK、CDI之间的关系,探讨Stat3信号传导通路对喉癌细胞G1～S期调控的可能机制。方法1用Stat3正义寡核苷酸和Stat3反义寡核苷酸用脂质体Lipofectamine 2000包裹转染Hep-2细胞,作为转染组细胞。将脂质体转染的细胞作为未转染组(对照组)细胞。2 MTT法检测不同浓度(100、150、200、300、400 nmol/L) Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON对转染组及未转染组Hep-2细胞作用24h、48h及72h后细胞的增殖情况。3流式细胞技术检测加入Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON至终浓度200 nmol/L作用24h、48h及72h后细胞周期情况。4 Western Blot法检测转染Stat3反义寡核苷酸72h后,Hep-2细胞的细胞周期素CyclinD1、CyclinE与细胞周期素依赖性激酶CDK2、CDK4、CDK6;以及细胞周期素依赖性激酶抑制因子p21、p27的蛋白表达水平。结果1荧光显微镜观察寡核苷酸转染Hep-2细胞状况:荧光显微镜下各浓度ASODN转染组均可见绿色荧光。脂质体-寡核苷酸转染复合物转染30min进入细胞质,1h后80%～90%细胞可见细胞核内荧光,同时细胞浆中也有较强的荧光分布,2h后达90%以上。2 Stat3信号传导通路对喉癌细胞G1~S期转换起重要作用。2.1 Hep-2细胞转染Stat3反义寡核苷酸后,细胞增殖水平下降,而相应对照组、转染正义寡核苷酸组变化不明显。2.2 Stat3反义寡核苷酸作用于Hep-2细胞72h后,G1期细胞比率由55.7%上升至62.9%,S期细胞比例由33.6%下降至15.9%。表明Stat3反义寡核苷酸(200 nmol/L)作用于喉癌细胞系Hep-2细胞可以抑制其Gl -S转化,形成G1阻滞。3 Stat3信号传导通路对喉癌细胞G1~S期Cyclin与CDK的调节作用:转染Stat3反义寡核苷酸72h后,Hep-2细胞的细胞周期素CyclinD1、CyclinE与细胞周期素依赖性激酶CDK2、CDK4、CDK6都出现不同程度的下调。4 Stat3信号传导通路对细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CKI)的调节作用:转染Stat3反义寡核苷酸72h后,Hep-2的细胞周期素依赖性激酶抑制因子p21、p27的蛋白表达升高。第三部分Stat3反义寡核苷酸联合化疗调控喉癌细胞增殖与凋亡分子机制的研究目的:利用反义寡核苷酸干扰技术阻断喉癌细胞系Hep-2中活化的Stat3信号通路后,探讨对喉鳞癌细胞增殖、凋亡的影响等及在减低喉癌化疗抵抗和增强其对化疗药物DDP敏感性的可能性。方法1用Stat3正义寡核苷酸和Stat3反义寡核苷酸用脂质体Lipofectamine 2000包裹转染喉癌细胞系Hep-2细胞,作为转染组细胞,分为Stat3 S-ON组、Stat3 AS-ON组、DDP组、DDP+Stat3 AS-ON组;将脂质体转染的细胞作为未转染组(对照组)细胞;Hep-2细胞加无血清培养基为空白对照组。2 MTT法检测不同浓度(100、150、200、300、400 nmol/L)Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON,以及DDP(最终质量浓度4μg/ml)对转染组及对照组Hep-2细胞作用后0h、24h、48h及72h的细胞增殖情况。3流式细胞技术检测Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON至终浓度200nmol/L,以及DDP至最终质量浓度为4μg/ml作用转染组及对照组Hep-2细胞后0h、24h、48h及72h的细胞周期变化情况。4流式细胞技术检测Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON至终浓度200 nmol/L,以及DDP至最终质量浓度为4μg/ml作用转染组及对照组Hep-2细胞后0h、24h、48h及72h的细胞凋亡情况。5 Western Blot法检测Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON至终浓度200 nmol/L,以及DDP至最终质量浓度为4μg/ml作用转染组及对照组Hep-2细胞72h后Stat3、p-Stat3及其靶基因产物Bcl-xl、CyclinD1的蛋白表达水平。结果1 Stat3在喉癌细胞系Hep-2细胞中持续表达和磷酸化:Western blot检测结果表明喉癌细胞株中Stat3蛋白持续表达且有一定程度的磷酸化。2 Stat3 AS-ON对喉癌细胞系Hep-2细胞增殖活力有抑制作用2.1 MTT检测表明对照和正义核酸组没有抑制肿瘤细胞的增殖作用。2.2反义核酸转染后48h,在0到200nmol/L范围内,浓度越高,其增殖抑制效应越强,本实验条件中96孔板最适浓度为200nmol/L,但是并不能够完全抑制肿瘤细胞的增殖。2.3反义转染后不同时间内检测,转染后12h反义核酸即开始表现出一定的增殖抑制效应,36h起表现出明显的抑制效应,细胞活力持续下降(F=5.26,P=0.004)。2.4 DDP组表现出一定的增殖抑制效应。2.5 Stat3 AS-ON与DDP作用于Hep-2细胞后,细胞增殖水平明显下降。3 Stat3 AS-ON对喉癌细胞系Hep-2细胞周期的阻滞作用:Stat3 AS-ON与DDP作用于Hep-2细胞72h后,G1期细胞比率由55.7%上升至74.9%,S期细胞比率分别由33.6%,下降至6.9%。Stat3 S-ON组、脂质体组、对照组细胞其S期比例在28%～34%之间。Stat3AS-ON+DDP组74.9%的细胞阻滞于G0/G1期,高于Stat3 S-ON组、脂质体组、对照组。4 Stat3 AS-ON与DDP对喉癌细胞系Hep-2细胞凋亡的促进作用:Stat3 AS- ON与DDP共同作用于Hep-2细胞72h后,Stat3AS-ON+DDP组、DDP组、Stat3 AS-ON组、Stat3 S-ON组、脂质体组、对照组凋亡率分别为32.9%、13.5%、28.1%、3.18%、2.35%、1.78%;统计结果表明反义寡核苷酸与Hep-2细胞作用后凋亡细胞增多,Stat3AS-ON+DDP组与Stat3 S-ON组(F=4.717,P=0.008)、Stat3AS-ON+DDP组与脂质体组(F=5.554,P=0.007)、Stat3AS-ON +DDP组与对照组(F=4.796,P=0.006)相比差异均有统计学意义。Stat3 S-ON组、脂质体组、对照组之间相比差异无统计学意义。5 Stat3 AS-ON与DDP可以使Stat3信号转导通路成员活性与表达下降:Stat3 AS-ON与DDP作用于Hep-2细胞72h后,Stat3及p-Stat3蛋白表达与活性下调,其靶基因产物Bcl-xl与CyclinD1表达下降。第四部分JAK激酶抑制剂AG490联合化疗抑制喉癌细胞Stat3信号转导通路的研究目的:利用JAK- Stat途径特异性抑制剂AG490作用于喉癌细胞系Hep-2细胞株,并与DDP联合应用,研究信号转导抑制剂及化疗对肿瘤细胞的影响,探讨Stat3信号转导通路在药物治疗喉癌中的作用。方法1用JAK激酶抑制剂AG490及DDP分别或联合作用于喉癌细胞系Hep-2为试验组,分为AG490组、DDP+AG490组及DDP组;Hep-2细胞加无血清培养基为空白对照组。2 MTT法检测试验组分别加入AG490和/或DDP后0h、24h、48h及72h细胞的增殖情况。3流式细胞技术检测试验组分别加入AG490和/或DDP后0h、24h、48h及72h的细胞周期情况。4流式细胞技术检测试验组分别加入AG490和/或DDP后0h、24h、48h及72h的细胞凋亡情况。5 Western Blotting法检测AG490和/或DDP作用于喉癌细胞系Hep-2细胞72h后Stat3、P-Stat3及其靶基因产物Bcl-xl、CyclinD1的蛋白表达水平。结果1 Stat3在喉癌细胞系Hep-2细胞中持续表达和磷酸化。2 AG490与DDP对喉癌细胞系Hep-2细胞增殖活力的抑制作用。MTT检测表明:对照组没有抑制肿瘤细胞的增殖作用,AG490转染后不同时间检测,转染后12h开始表现出一定的增殖抑制效应,36h表现出明显的抑制效应,细胞活力持续下降(F=5.26,P=0.004);DDP组表现出一定的增殖抑制效应;AG490与DDP作用于Hep-2细胞后,细胞增殖水平明显下降。AG490+DDP组与DDP组相比差异有统计学意义(F=4.856,P=0.008)。3 AG490对喉癌细胞系Hep-2细胞周期的阻滞作用。AG490与DDP作用于喉癌细胞系Hep-2细胞72h后,G1期细胞比率由55.5%上升至70.7%,S期细胞比率分别由33.1%,下降至25.7%,细胞增殖受抑制。AG49+DDP组70.7%的细胞阻滞于G0-G1期,高于AG49、DDP、对照组。计算差异有统计学意义。4 AG490与DDP对喉癌细胞系Hep-2细胞凋亡的促进作用。AG490与DDP共同作用于Hep-2细胞72h后,凋亡细胞百分比分别由2.34%,增加至31.32%。AG490+DDP组、DDP组、AG490组、对照组凋亡率分别为31.32%、23.5%、14.1%、5.14%;统计结果表明AG490与DDP作用Hep-2细胞后凋亡细胞增多,AG490+DDP组与对照组相比,差异有统计学意义(F=4.824,P=0.005)。5 AG490与DDP可以使Stat3信号转导通路成员活性与表达下降。AG490与DDP作用于喉癌细胞系Hep-2细胞72h后, Stat3蛋白表达与活性下调,其靶基因产物Bcl-xl与CyclinD1表达下降。结论1.首次在喉鳞癌组织及细胞系中对Stat3信号通路的激活情况进行检测,从蛋白水平、定位及定量表达、基因水平表达等不同侧面研究证实了在喉鳞癌中存在着组成性激活的Stat3信号通路。2.喉鳞癌组织和正常喉粘膜组织中Stat3蛋白及p-Stat3蛋白的表达有差异,p-Stat3的表达具有异质性,p-Stat3在癌细胞中异常激活具有不同步性。Stat3与p-Stat3蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤T分级、肿瘤部位无关,但与肿瘤组织的分化程度、临床分期和有无淋巴结转移有关。Bcl-xl蛋白的表达情况同肿瘤的分化水平相关,在分化降低的过程中Bcl-xl有下调的趋势,表明激活的Stat3信号通路在喉鳞癌发生、发展以及浸润转移中起着一定的作用。3.利用反义干扰技术,能高效特异地阻断Stat3信号通路的组成性激活,诱导肿瘤细胞发生凋亡,使细胞周期停滞,抑制喉鳞癌细胞的增殖,表明Stat3信号传导通路对于喉癌细胞G1～S期起着重要的调控作用,通过调节CDK/Cyclin复合物与CKI成员之间的平衡而调节喉癌细胞异常增殖,介导细胞恶性转化。提示活化的Stat3信号通路是喉癌基因治疗中一个理想分子靶点。4. JAK激酶抑制剂阻断Stat3信号通路以后,肿瘤细胞中Stat3下游抗凋亡基因Bcl-xl与CyclinD1的表达也受到阻断,细胞发生凋亡,Bcl-xl蛋白表达水平在AG490作用后逐渐降低,细胞凋亡明显增加,表明AG490对Hep-2细胞的促凋亡作用和JAK- Stat3-Bcl-xl途径有关。5.阻断Stat3信号通路的组成性激活,恶变转化细胞的生存和生长对Stat3信号途径呈不可逆的依赖,提示喉癌细胞耐药可能与Stat3异常激活有关;AG490能够增加肿瘤细胞对化疗药物DDP的敏感性,二者产生协同抗肿瘤作用。6.反义Stat3不能够完全抑制肿瘤细胞的增殖,对细胞凋亡的诱导作用也有一定限度;表明反义Stat3本身对肿瘤细胞的杀伤作用有一定局限性,不能通过无限制的提高反义核酸的浓度来提高其杀肿瘤的作用,Stat3 AS-ON可以协同化疗药物DDP的治疗作用,表明靶向Stat3的干扰技术有可能成为喉癌基因治疗的新策略。