研究背景及目的:干细胞移植治疗急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)已成为全球研究的新趋势。心脏干细胞(Cardiac Stem Cells,CSCs)具有再生修复梗死心肌,促进新生血管形成,从而降低心肌梗死后梗死面积,改善梗死区域微循环作用,因此被认为在治疗MI方面具有强大的潜力。然而,CSCs移植治疗MI仍遇到一些瓶颈问题,即CSCs移植至心肌梗死后恶劣微环境中干细胞存活力极低,分化增殖能力受抑制,不能有效的达到受损心肌再生修复的作用,因此目前认为CSCs主要通过旁分泌机制,改善局部心肌梗死微环境,促进心肌细胞存活及局部血管新生发挥作用。外泌体(Exosomes)是纳米级的膜性封闭囊泡,其内包含多种蛋白质和核酸,成为细胞间传递信息的关键中介,而外泌体主要通过非编码RNAs发挥效应,其中circRNAs因具有更好保守性,成为目前研究的热点。随着研究的深入,近来发现circRNAs中circHIPK3具有心脏保护及再生新生微血管的作用。现已研究证实circHIPK3可促进糖尿病视网膜血管的生成。另有研究报道过表达circHIPK3可抑制膀胱癌细胞的迁移、新生血管形成。那么circHIPK3能否促进急性心肌梗死后梗死区域新生血管形成,改善梗死区域微循环,促进梗死区域心肌的修复能力,降低心肌梗死面积?这些问题目前尚未报道。因此,本研究拟探讨心脏干细胞源exosomes可通过传递circHIPK3再生修复梗死后心肌及血管网络,为心脏干细胞的非细胞治疗奠定基础。第一部分方法:(1)获取3-4周龄SD大鼠左心耳,利用酶消化法联合MACS法体外分离、培养及分选c-kit~+CSCs,传代培养。MACS分选后获取c-kit~+CSCs的鉴定:采用流式细胞术鉴定CSCs纯度,采用免疫荧光观察CSCs中C-kit的表达。(2)采用UC法提取c-kit~+CSCs来源的Exosomes,利用BCA试剂盒测定Exosomes的浓度。c-kit~+CSCs来源Exosomes的鉴定:透射电子显微镜(TEM)观察Exosomes的形态大小;纳米粒子追踪分析(NTA)检测Exosomes的粒径大小及分布范围;Western blot检测Exosomes表面标记蛋白CD9、CD63、HSP70的表达。(3)以慢病毒为载体体外转染过表达circHIPK3、沉默circHIPK3及慢病毒载体至c-kit~+CSCs,感染预实验分为四组:(1)完全培养基,加病毒感染;(2)含5ug/ml polybrene的完全培养基,加病毒感染;(3)Enhance Infection Solution,加病毒感染;(4)含5ug/mlpolybrene的Enhance Infection Solution,加病毒感染。每组设置1,10,100不同梯度的感染复数(MOI),慢病毒感染4天后,荧光显微镜观察荧光表达情况,以此确认c-kit~+CSCs的转染条件和转染效率。(4)实验分组:(1)Control组:不予任何处理的c-kit~+CSCs来源Exosomes;(2)LV-exo组:空载体慢病毒转染c-kit~+CSCs来源Exosomes;(3)LV-circ-exo组:携带过表达circHIPK3基因慢病毒载体转染c-kit~+CSCs并提取其exosomes;(4)LV-SiR-circ-exo组:携带沉默circHIPK3基因慢病毒载体转染c-kit~+CSCs并提取其Exosomes;以RT-PCR分别检测各组细胞来源Exosomes中circHIPK3的表达量。(5)40只SD大鼠,体重约200-250g,分为2组:假手术组(Sham组)和心肌梗死模型组(MI组)。Sham组在气管插管呼吸机辅助通气下仅开胸,不结扎左冠状动脉前降支,而MI组在气管插管呼吸机辅助通气下开胸结扎左冠状动脉前降支。判断心肌梗死模型是否建立成功,冠状动脉结扎前后行心电图检查,术后4周行超声心动图检查,术后4周取心脏组织制成石蜡切片行HE染色和Masson染色观察心肌梗死情况。结果:(1)利用酶消化法体外分离培养的原代CSCs大小形态均一,24h后即可贴壁,呈长三角形及多角形生长,折光率高。3天后可见少量细胞贴壁生长,杂细胞相对较多。5天后可见大部分细胞贴壁尚好,呈长三角形及多角形生长,细胞开始扩增,杂细胞较前减少,可见少量细胞融合。7-8天后细胞形态均一,融合50%-60%左右。10天后铺满整个瓶底,扩增速度明显加快,形态无明显变化,可见80%-90%细胞融合。MACS分选后获得CSCs镜下立即观察可见小圆形或椭圆形且折光率较高的目的细胞,其间可见散在磁珠。1天后可见少量呈三角形或多角形细胞贴壁生长,部分表面结合有折光率较高的磁珠。3天后细胞扩增速度明显增加,形态仍呈三角形或多角形,细胞密度达50%左右。5天后细胞继续增殖,形态未见明显变化,细胞融合可达80%-90%。MACS分选后获取的c-kit~+CSCs经流式细胞术鉴定结果显示,CSCs表达CD34约0.40%,表达CD45约1.28%,而表达c-kit的CSCs达91.62%,免疫荧光观察结果显示CSCs表达c-kit分子达90%以上。(2)BCA试剂盒测定Exosomes的浓度为2.77mg/ml。采用TEM、NTA及Western blot对Exosomes进行鉴定,结果显示,TEM观察到大小不一、圆形或类圆形的囊状小泡,外见脂质双层膜包裹,中间可见光亮区;NTA检测Exosomes的粒径大小约为93.6nm;Western blot检测Exosomes的表面标记蛋白CD9、CD63及HSP70均呈阳性表达。(3)以慢病毒为载体体外转染过表达circHIPK3、沉默circHIPK3及慢病毒载体至c-kit~+CSCs,免疫荧光观察结果显示,c-kit~+CSCs在完全培养基中容易被感染,感染4天后MOI为100时就能达到90%以上的感染效率。因此,以完全培养基和MOI值为100作为转染条件满足后续实验的需求。(4)RT-PCR分别检测各组细胞来源Exosomes中circHIPK3的表达量,结果显示,Control组与LV-exo组间无明显统计学意义,与Control组相比,LV-circ-exo组中circHIPK3表达量显著增高(P<0.01),而LV-SiR-circ-exo组中circHIPK3表达量显著降低(P<0.01)。(5)MI组SD大鼠手术成功率80%,术后大鼠精神状态萎靡、反应迟钝,活动减弱,毛发稀疏无光泽,呈黄白色,呼吸频率增快、变浅,进食量明显减少。左冠状动脉结扎后心电图提示I、II肢体导联ST明显抬高;MI模型术后4周行超声心动图检查,MI组左心室腔扩大,左心室壁节段性运动减弱或消失,梗死区域局部室壁变薄,LVEF值和LVFS值较Sham组均明显降低(P<0.01),LVSd值和LVDd值较假手术组明显增大(P<0.01);MI模型术后4周行HE染色,MI组心肌细胞排列紊乱,轮廓模糊,肌纤维增粗变性、坏死,正常心肌细胞由纤维组织替代;Masson染色结果显示,MI组可见大量染成蓝色的胶原纤维,梗死周边区域可见少量呈红色的正常心肌组织。结论:(1)利用酶消化法联合MACS分选获得纯度高且生长状态良好的c-kit~+CSCs,符合其细胞形态和特征。(2)UC法提取的Exosomes浓度较高,经TEM、NTA及Western blot鉴定,符合Exosomes的形态和特征。(3)以慢病毒为载体可成功将circHIPK3转染至c-kit~+CSCs内,在完全培养基中MOI值为100时就能达到90%以上的转染效率,满足后续实验的需求。(4)气管插管呼吸机辅助通气下结扎左冠状动脉前降支,可以成功制备MI大鼠模型,为后续实验做准备。第二部分方法:(1)用100ul浓度为1ug/ml DiI工作液标记UC法提取转染后c-kit~+CSCs来源的新鲜Exosomes,MI模型建立成功后局部注射至心肌梗死局部区域。(2)实验分为五组:(1)假手术组(Sham组),仅开胸,未结扎左冠状动脉前降支;(2)心肌梗死对照组(Control组),心肌梗死区域局部注射PBS液;(3)转染慢病毒载体c-kit~+CSCs来源Exosomes组(LV-exo组),心肌梗死区域局部注射转染慢病毒载体至c-kit~+CSCs来源Exosomes;(4)转染携带过表达circHIPK3基因慢病毒载体c-kit~+CSCs来源Exosomes组(LV-circ-exo组),心肌梗死区域局部注射转染携带过表达circHIPK3基因慢病毒载体至c-kit~+CSCs来源Exosomes;(5)转染携带沉默circHIPK3慢病毒载体c-kit~+CSCs来源Exosomes组(LV-siR-circ-exo组),心肌梗死区域局部注射转染携带沉默circHIPK3基因慢病毒载体至c-kit~+CSCs来源Exosomes。各组大鼠术前、术后7天、术后14天及术后28天行超声心动图检查比较各组间LVEF值、LVFS值、LVDd值及LVSd值;MI模型术后4周处死大鼠取出心脏组织制成冰冻切片,免疫荧光观察心肌内Exosomes-Di I的内化情况;TTC染色观察比较各组间心肌梗死面积;HE染色观察比较各组间心肌纤维化面积;Masson染色观察比较各组间心肌梗死面积;免疫组织化学观察比较各组间新生微血管的密度和数量。结果:(1)Di I标记的Exosomes注射至心肌梗死局部区域,荧光显微镜观察到心肌内可见红色荧光,说明心肌内吞了Exosomes。(2)Exosomes移植治疗心肌梗死后,超声心动图检查结果显示,LV-circ-exo组LVEF值和LVFS值均明显高于Control组(P<0.01),LV-circ-exo组LVDd值和LVSd值均明显低于Control组(P<0.01),LV-SiR-circ-exo组中LVEF值和LVFS值均明显低于Control组(P<0.01),LV-SiR-circ-exo组中LVDd值和LVSd值均明显高于Control组(P<0.01);与LV-circ-exo组相比,LV-SiR-circ-exo组中LVEF值和LVFS值均显著减小(P<0.01),LVDd值和LVSd值均显著增大(P<0.01)。TTC染色结果显示,非梗死区域心肌组织染成砖红色,梗死区不着色;与Control组相比,LV-circ-exo组心肌梗死面积明显减小(P<0.05),LV-SiR-circ-exo组心肌梗死面积明显增大(P<0.05),LV-circ-exo组心肌梗死面积比LV-SiR-circ-exo组明显减小(P<0.05)。HE染色结果显示,与Control组相比,LV-circ-exo组心肌纤维化面积显著减小(P<0.05),LV-Si R-circ-exo组心肌纤维化面积显著增大(P<0.05),LV-circ-exo组心肌纤维化面积比LV-SiR-circ-exo组显著减小(P<0.05)。Masson染色结果显示,Sham组正常心肌组织染成红色,MI组心肌梗死区域染成蓝色;与Control组相比,LV-circ-exo组心肌梗死面积明显减小(P<0.01),LV-SiR-circ-exo组心肌梗死面积明显增大(P<0.01),LV-circ-exo组心肌梗死面积比LV-SiR-circ-exo组明显减小(P<0.01)。免疫组织化学检测结果显示,新生微血管内皮细胞常被染成棕黄色,细胞核染成蓝色;与Control组相比,LV-circ-exo组心肌梗死周边区新生微血管密度明显增加(P<0.05),LV-SiR-circ-exo组心肌梗死周边区新生微血管密度明显减少(P<0.05),与LV-circ-exo组相比,LV-SiR-circ-exo组心肌梗死周边区新生微血管密度明显减少(P<0.05)。结论:在体内实验中,过表达circHIPK3具有新生微血管形成的作用,提高心肌的再生修复能力,降低心肌梗死面积,改善心功能。