一、研究背景和目的感音神经性耳聋是最常见的听觉残疾,听觉的产生和维持依赖于耳蜗内毛细胞(IHC)带状突触部释放谷氨酸神经递质,由此完成机械-电换能作用[1]。作为听觉传导第一级突触,耳蜗IHC突触发生病理改变是导致感音神经性耳聋的重要原因之一[2,3]。大量研究表明,听功能的减退与带状突触形态、结构和数量的异常变化密切相关[3]。每个IHC与螺旋神经元建立一个突触连接,单个IHC拥有10-30个带状突触。耳蜗IHC带状突触活性区域的快速可释放池(RRP)释放出的神经递质谷氨酸激活位于突触后膜的谷氨酸受体(AMPA),将听觉信息传递给蜗核的对应神经元[4]。可见,耳蜗感受到的绝大部分声信号是靠IHC及其突触完成的。每个RRP有数十个囊泡附着,可在几微秒内释放囊泡,大量囊泡的同步释放可通过兴奋性突触后电位(EPSPs)反映[5]。根据听觉信号传导的特点,IHC突触精确快速地传递神经递质需要正常有效的囊泡循环机制,即囊泡的胞吐和胞吞[6]。突触囊泡循环(recycling)是听觉神经递质持续释放的基础,而突触囊泡精确快速的内吞回收则是囊泡信息持续传递不被耗竭的重要保障。网格蛋白介导的内吞(CME)途径是中枢神经细胞突触囊泡膜回收的重要方式[7],AP-2蛋白为内吞起始阶段识别网格蛋白和协同其它辅助蛋白形成网格蛋白包被小泡(coated pits)的结构核心,它是由α、β2、μ2和σ2四个亚基组成的大的蛋白复合体,α亚基附件区域与质膜形成联系,同时通过DPF或者DPW分子信号与多种调控蛋白和辅助蛋白结合;β2亚基与网格蛋白β螺旋末端结构域结合,还与转运货物(cargo)的选择相关;μ2亚基通过酪氨酸分类信号识别胞质尾区受体[8]。AP-2蛋白在CME内吞起始阶段发挥着重要作用。耳蜗IHC及其传入神经元作为一种特殊的神经突触,AP-2蛋白调控CME途径理论上应该在此区域发挥着重要作用。目前关于AP-2蛋白的研究多局限于它的蛋白组学和它在中枢神经细胞的研究,AP-2蛋白在小鼠耳蜗中的定位表达及功能关系尚不清楚。本研究拟应用免疫荧光双重标记,激光共聚焦显微镜观察ap-2蛋白与带状突触前膜特异性蛋白rebeye/ctbp2在小鼠耳蜗毛细胞中的定位表达特点,探讨其在内耳听觉生理中的可能作用机制。再结合听性脑干反应(abr),荧光定量pcr(qrt-pcr)观察出生后不同发育阶段ap-2蛋白的表达,探讨ap-2蛋白与听功能的发生、形成和年龄相关性听力减退的相关性。最后通过膜片钳电生理方法,采用tyrphostina23(酪氨酸磷酸化抑制剂a23)抑制ap-2蛋白的衔接功能,进而影响cme的胞吞作用,通过研究ap-2蛋白的特异性抑制致小鼠耳蜗ihc电生理的改变情况,初步探讨ap-2蛋白在耳蜗ihc突触囊泡胞吞的可能作用机制,为研究感音神经性耳聋在蛋白质水平的发病机制提供参考。二、材料与方法1、选择健康成年c57bl/6j(8周龄)小鼠20只,耳廓反应灵敏,abr阈值正常。通过ap-2和dapi双重标记以及ap-2、ctbp2和dapi三重标记,应用免疫荧光标记技术结合激光共聚焦显微镜观察ap-2蛋白在耳蜗毛细胞的定位与表达。2、选用7、15、35日、及16月龄小鼠各20只,分别代表新生小鼠、听功能发育阶段小鼠、听功能发育成熟小鼠及老年性小鼠,通过免疫荧光激光共聚焦显微镜,qrt-pcr技术检测基底膜内毛细胞ap-2蛋白的表达特点,结合abr测定小鼠听阈等讨论听功能的发生、形成、以及年龄相关性听功能减退与小鼠耳蜗ap-2蛋白表达的相关性。3、通过tyrphostina23(酪氨酸磷酸化抑制剂a23)抑制yxxФ分子信号与ap-2μ2亚基的相互作用,分析内毛细胞ap-2蛋白被特异性抑制后小鼠ihc电生理的改变情况,从而反映ap-2蛋白对cme的影响。三、结果:1、ap-2蛋白属于细胞胞浆蛋白,主要表达于ihc突触活化部位,浓集于胞质基底外侧,靠近传入神经元区域。ap-2蛋白表达的形态学定位位点与其调控cme途径的功能学相映衬。2、abr阈值测定发现,p15、p35、16月龄小鼠听阈分别为18.67±1.21dbnhl,13.83±1.47dbnhl和37.83±7.68dbnhl,p7组小鼠听力尚未引出。软件计算p7、p15、p35及16月龄组荧光染色密度值(imv)分别为:190.91±17.27,494.06±27.63,838.41±38.23,682.65±72.22;qrt-pcr测定p7、p15、p35及16月龄组ap-2mrna相对表达量(rq)分别为0.53±0.09,1.03±0.02,1.00±0.09,1.03±0.06。p7与p15组比较,随着听功能的产生和形成,免疫荧光光密度值和ap-2mrna相对表达量均提示AP-2的表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);P35与16月龄组比较,老年组AP-2蛋白荧光光密度值减少,然而通过q RT-PCR分析两者AP-2 mRNA的表达水平,差异无明显统计学意义(P>0.05)。3、通过Tyrphostin A23的抑制作用,AP-2蛋白的衔接功能受阻碍,进而影响CME路径,IHC电压依赖性Ca2+通道开放和关闭延迟,ICa2+减小,△Cm降低,IHC膜电容及钙电流的改变表明AP-2蛋白调控的CME途径在IHC突触区域参与了囊泡的内吞作用。四、结论1、AP-2蛋白在成年小鼠耳蜗中主要表达于IHC突触活化区域,形态学的定位位点与其调控CME途径的功能学相符合,间接反映了AP-2蛋白与突触的关联及意义,它可能在IHC突触囊泡的内吞中发挥着重要作用,为深入探索AP-2蛋白在内耳听觉生理和病理中的作用奠定了基础。2、AP-2蛋白在小鼠内耳发育不同阶段均有不等强度的表达,新生小鼠至听力的产生和发育成熟阶段,耳蜗AP-2蛋白随小鼠日龄增大而表达增强,提示AP-2蛋白的表达水平可能与听功能的发生、形成和维持密切相关。3、特异性抑制AP-2蛋白的功能,能影响CME途径,突触间隙内神经递质不能被IHC突触前膜有效地内吞回收,影响了突触循环,最终影响了IHC神经递质的释放。说明AP-2蛋白在调控小鼠耳蜗IHC的突触囊泡回收中发挥着重要重要。