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18S rRNA基因是一类编码核糖体小亚基RNA、长约1800bp的DNA序列,由于在生物体内含量较大占80﹪左右,且在进化过程中非常保守,核苷酸的替换率较低,因而它是探讨生物高级分类群系统演化的难得工具之一.该实验克隆并比较了旋毛虫5个隔离种的18S rRNA基因序列,分析他们的同源性,为旋毛虫的分类和诊断开辟了新的途径.旋毛虫排泄分泌(Excretory-Secretory antigen,ES)抗原,即旋毛虫生长过程中的排泄分泌产物,是旋毛虫检测和免疫的良好抗原.该实验将本地毛形线虫(Trichinella nativa)ES抗原的49ku结构基因构建到杆状病毒表达载体上,并在昆虫细胞中得到表达.该实验以NCBI中U60231序列为参考,设计并合成引物,用改进的AGPC方法结合Trizol LS试剂盒提取旋毛虫总RNA,用分光光度计检测RNA的质量.然后用特异性引物,对旋毛虫标准隔离种旋毛形线虫(Trichinella spiralis)和本地毛形线虫(Trichinella nativa),以及分离自黑龙江省的猪旋毛虫、犬旋毛虫和猫旋毛虫5个旋毛虫隔离种进行RT-PCR扩增目的基因18S rRNA片段,均扩增出1800bp左右的基因片段.将目的基因与克隆载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌JM109中,筛选阳性重组子,并将阳性质粒送有关生物公司测序,同时在哈尔滨兽医研究所生物技术重点实验室也进行测序.用DNAstar和Genedoc软件分析结果显示,18S rRNA基因的种间同源性很高,均在99﹪以上.猪旋毛虫与旋毛形线虫的同源性为99.4﹪,犬旋毛虫与本地毛形线虫的同源性为99.3﹪,猫旋毛虫与旋毛形线虫比与本地毛形线虫的同源性要略高0.4﹪.因此,猪旋毛虫与旋毛形线虫,犬旋毛虫与本地毛形线虫的亲缘关系更近,这与传统分类学的结果相符合.本地毛形线虫和猪旋毛虫的18S rRNA基因序列已经提交NCBI,序列号分别为AY487254和AY497012.这为旋毛虫分类学的研究开创了一种新的方法和思路.根据BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统的供体质粒,设计表达引物,从克隆质粒上扩增本地毛形线虫49ku ES结构基因,酶切后与供体质粒连接,在大肠杆菌中克隆,将克隆有外源基因的供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,该细胞含有杆状病毒穿梭载体,供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下,通过转座而插入杆状病毒基因组中,筛选含有重组质粒的Bacmid DNA,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒.SDS-PAGE电泳显示表达蛋白为36ku的融合蛋白,将表达产物进行Western blot检测,可以被小鼠旋毛虫的阳性血清识别.实验结果表明,旋毛虫的ES抗原在诊断和免疫方面具有很好的应用前景.