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光学纯的双芳基醇是一类重要的手性砌块化合物,可广泛地用于药物、农业化学品和天然产物的合成。光学纯（S）-（4-氯苯基）-（吡啶-2-基）甲醇[（S）-CPMA)]是合成抗组胺贝托司汀类药物的重要手性中间体,可通过不对称还原其前体（4-氯苯基）-（吡啶-2-基）甲酮（CPMK）而获得。由于底物酮的双芳基结构具有极大的空间位阻,只有少量醇脱氢酶被报道具有不对称催化还原双芳基酮的活力,因此它们通常被称为“难还原”的酮类。在前期工作中,本课题组采用基因挖掘的方法获得了来源于Kluyveromyces polyspora的NADPH依赖型短链醇脱氢酶Kp ADH,该酶催化还原CPMK时表现出较高的底物转化率和中等的立体选择性（82%ee,R）。本研究以KpADH为研究对象,对其进行蛋白质工程改造以获得高立体选择性的生物催化剂,并对该醇脱氢酶的立体选择性催化机制及酶法连续制备（S）-CPMA进行了研究。主要结论如下:（1）根据2,4-二硝基苯肼（DNPH）与羰基化合物的颜色反应特性,建立了醇脱氢酶催化还原活力的高通量筛选方法。该方法具有成本低廉、灵敏度高、背景干扰小等优点,可用于以芳香酮、双芳香酮、脂肪酮、二酮为底物的羰基还原酶催化活力的高通量筛选。当以CPMK为底物时,其与DNPH反应生成产物在波长500 nm处具有特征吸收峰,计算摩尔消光系数为13750·L·mol-1·cm-1。该DNPH检测法可适用于全细胞反应体系及羰基还原酶底物特异性的表征。将该方法用于KpADH随机突变库的高通量筛选,获得了三个催化活力提高的突变体M131F,S196Y和S237A,它们的催化活力分别为野生型Kp ADH的1.5,1.3和1.8倍。此外,手性HPLC色谱检测结果显示突变体S196Y还原产物（R）-CPMA的ee值下降至74.7%,突变体S237A催化还原合成（R）-CPMA的ee值提高至96.1%,显示出Kp ADH立体选择性改造的潜力。（2）以来源于Saccharomyces cerevisiae的NADPH依赖型甲基乙二醛还原酶GRE2为模板构建Kp ADH的同源模型,确定其催化三联体为Ser126-Tyr164-Lys168;之后将其与底物CPMK分子进行半柔性对接,获得了KpADH底物结合口袋上16个氨基酸位点。选择天冬氨酸Asn和Val分别作为“极性筛子”和“非极性筛子”,对16个残基位点进行扫描,得到6个与Kp ADH立体选择性相关的突变位点Q136,F161,S196,E214,T215和S237。之后基于这些位点饱和突变库的筛选结果采取“逐步优化组合策略”构建突变文库,筛选获得了立体选择性提高的突变体Mu-R2（99.2%ee,R）和立体选择性翻转的突变体Mu-S5（97.8%ee,S）。（3）为了研究双芳基醇脱氢酶催化立体选择性识别机制,对WT Kp ADH及其突变体Mu-R2及Mu-S5进行蛋白质结晶,获得了这三个蛋白与NADPH的复合物晶体,分辨率分别为1.98?（5Z2X）,2.20?（5ZED）和1.78?（5ZEC）。选择距离参数d(O14CPMK-H9Y164)≤3.4?和d(C7CPMK-H4NPH)≤4.5?衡量酶催化底物过程中的预反应状态,分子动力学模拟结果显示Mu-R2与CPMKProR及Mu-S5与CPMKProS更易形成预反应状态。对于突变体Mu-S5,其底物结合口袋入口处突变位点N136,V161,C237和G214的α-碳原子可形成类平面的“极性门”。由于底物潜手性碳两侧氯苯环和吡啶环的带电差异,在催化过程中底物的取向在其穿过“极性门”时即被决定。对于野生型KpADH,类似的平面被周围芳香族氨基酸残基的侧链阻挡,从而使底物在接近催化中心时无法保持单一取向。（4）建立双芳基醇脱氢酶Kp ADH和葡萄糖脱氢酶BmGDH偶联反应体系,将双酶共固定化实现双芳基手性醇（S）-CPMA的酶法连续合成。确定最佳酶活力比例为Mu-S5:BmGDH=2:1（U/U）,使用10 mL Ni-NTA对酶进行固定化,使用羟丙基-β-环糊精为助溶剂配制底物浓度为10 mM反应液,当流速为5 mL·min-1时反应1-3天底物转化率均为100%,计算反应时空产率为1560 g·L-1·d-1,使用D101树脂吸附产物,最终产物得率为84.0%。