论文部分内容阅读
背景：原发性肝细胞癌(Primary hepatocellular carcinoma)是世界范围内的第六大常见癌症,并且其死亡率排在所有癌症中的第三位。随着全球人口的增多与人口老龄化程度的加大,肝癌在全球范围内的的发展呈现出了日益严重的趋势。值得注意的是,超过-半的肝癌都发生在中国,严重的危害着我国人民的生命健康。EVL蛋白是Ena/VASP蛋白家族成员之一,主要涉及与肌动蛋白细胞骨架重组有关的功能,如轴突导向、细胞迁移和细胞间附着等。Ena/VASP家族蛋白在结构上非常保守,都由EVH1、Pro-rich和EVH2这三个结构域组成。在纤维母细胞中,Ena/VASP家族蛋白通过控制板状伪足内的肌动蛋白重组,从而调节细胞的运动速度。此外,EVL还能促进李斯特菌的运动。Ena/VASP家族蛋白在数种癌症中都展现出高表达的特征,实时定量PCR研究显示EVL蛋白在多数乳腺癌中患者血清中都呈高表达。本实验中发现,与正常肝细胞相比EVL在肝癌细胞中的表达量明显升高。研究EVL在肝癌细胞中的功能,有助于我们更加深入的了解肝细胞癌发生发展的机制,从而为肝细胞癌的治疗以及肝癌标志物的寻找提供有力依据。方法：利用Western Blot匕较了肝癌SMMC-7721细胞和正常肝L02细胞中EVL蛋白的表达量。为了研究EVL对于肝癌细胞的作用,构建了shRNA干扰载体转染肝癌SMMC-7721细胞抑制其EVL蛋白表达,使用lipofectamine2000转染细胞后,荧光显微镜观察转染效率；使用荧光定量PCR和Western Blot分别检测转染后肝癌SMMC-7221细胞EVL基因和蛋白水平的抑制效率。随后分别运用MTT实验,细胞集落形成实验,Transwell和流式细胞检测分析抑制EVL蛋白对肝癌SMMC-7721细胞增殖,侵袭及周期的影响。对比实验组与对照组的实验结果来分析EVL蛋白在肝癌细胞中的作用。结果：Western Blot结果显示,EVL蛋白在肝癌细胞中的表达量明显高于正常肝细胞。利用lipofectamine 2000将质粒转染进入肝癌SMMC-7721细胞后,细胞荧光显微镜下有明显绿色荧光,说明质粒被成功转染进入细胞并表达绿色荧光蛋白。荧光定量PCR和Western Blot检测结果分别显示shRNA-EVL质粒转染后,细胞内EVL在基因与蛋白水平的表达量都明显下降,说明shRNA-EVL干扰质粒进入肝癌细胞后成功抑制细胞内EVL的表达。MTT试验做细胞的生长曲线显示,抑制EVL蛋白的表达后肝癌细胞的生长速率明显下降。细胞集落形成实验中,连续培养14天后染色观察发现,shRNA-EVL转染的实验组克隆形成率明显低于对照组。Transwell侵袭实验中,实验组细胞穿膜数量明显低于对照组,表明EVL蛋白表达量的降低会导致肝癌细胞的侵袭能力降低。通过流式细胞仪检测各组细胞周期发现,抑制EVL蛋白表达后处于分裂期细胞减少,处于间期细胞增多,说明抑制EVL蛋白表达会导致肝癌细胞被阻断在G0/G1期。结论：抑制EVL蛋白的表达会导致肝癌SMMC-7721细胞侵袭和生长能力的降低,说明EVL在肝癌细胞的侵袭和增殖中起着重要的作用。