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肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor—α，TNF—α)是一种主要由单核细胞/巨噬细胞产生的、具有广泛生物学活性的细胞因子。在类风湿关节炎，肠炎和感染性休克等疾病的发生、发展中占有很重要的地位。TNF—α主要通过与其位于细胞膜上的Ⅰ型受体(TNF—R1)的细胞外区域结合之后，来启动其信号通路。TNF—R1的细胞外区域包含四个亚功能域，分别是CRD1(residues15-53)，CRD2(residues54-97)，CRD3(residues98-138)和CRD4(residues139-166)。其中CRD1，CRD2和CRD3分别由一个A1型模块和一个B2型模块构成，CRD4不同于其他三个亚功能域，它是由一个A1模块(residues139-150)和一个结构不规则的C2模块(residues153-172)构成。显然对于各个亚功能域来说，A1模块是相对保守的结构，极有可能在TNF—α和TNF—R1的结合过程中发挥重要作用，但目前国内外对于CRD4的A1模块在TNF—R1与TNF—α相互识别的过程中所起到的作用鲜有报道。
本研究旨在针对于TNF—R1的CRD4区域A1模块设计衍生小肽，检测其对于TNF—α和TNF—R1的结合的影响，对筛选出的优选肽已申请了专利保护(在后面的内容中将有所体现)，并且在细胞水平和整体水平进行系统评价筛选出的优选肽对于TNF—α致炎活性的抑制作用。我们的研究首次确证了TNF—R1的CRD4区域在TNF—R1与TNF—α相互识别的过程中发挥了重要作用。为进一步客观认识TNF—α和TNF—R1的结合模式，以及合理设计和开发TNF—α抑制剂提供重要的理论依据。
第1章TNF—R1的CRD4区衍生多肽的设计合成及初步活性筛选
目的：Ⅰ型TNF受体TNF—R1介导了TNF—α包括致炎作用在内的大部分生物学效应。然而目前人们对于TNF—R1的胞外区第4功能域CRD4在TNF—α与TNF—R1的相互作用过程中的作用尚不清楚。我们以CRD4的A1模块亲水段序列为模板设计短肽片段，观察合成的短肽对于TNF—α与受体TNF—R1结合的影响从而确证CRD4在TNF—α与TNF—R1的相互作用过程中的作用。
方法：
1.以TNF—R1胞外第4区域的A1模块疏水区为模板的天然结构为模板，采用Fmoc法多肽固相合成技术。
2.高效液相色谱分析法，及ESI—MS质谱分析法确定它们的纯度和分子量。
3.采用生物活性酶联免疫吸附测定法(BioLISA)观察所合成的肽段对于TNF—α与其受体TNF—R1结合情况的影响。
结果：
1.采用固相合成方法TNF—R1以胞外第4区域的A1模块疏水区氨基酸为模板，设计合成了四条多肽序列，分别是Pep1(NH2-Arg—Gly—Phe—Phe—Leu—Arg—Glu—Asn—COOH)，Pep2(NH2-Phe—Phe—Leu—Arg—Glu—Asn—Glu—Cys—COOH)，Pep3(NH2-Leu—Arg—Glu—Asn—Glu—Cys—Val—Ser—COOH)，以及Pep4(NH2-Leu—Arg—Glu—Asn—Glu—Cys—Val—Ser—Cys—Ser—Asn—COOH)。
2.BioLISA测试结果显示短肽Pep3和Pep4在浓度分别为20，40，60，80，100，120μM可剂量依赖性抑制TNF—α与其受体TNF—R1的结合；然而肽段Pep1和Pep2在浓度20，40，60，80，100，120μM时均未表现明显的抑制效果。
结论：
TNF—R1的CRD4的A1模块衍生小肽Pep3(NH2-Leu—Arg—Glu—Asn—Glu—Cys—Val—Ser—COOH)和Pep4(NH2-Leu—Arg—Glu—Asn—Glu—Cys—Val—Ser—Cys—Ser—Asn—COOH)都能够有效抑制TNF—α与其受体TNF—R1结合。虽然Pep3与Pep4的一级序列相差3个氨基酸残基(Cys153，Ser154，Asn155)，但二者对于TNF—α与其受体TNF—R1结合的抑制能力没有明显差异。说明TNF—R1的CRD4的A1模块区域内能够影响TNF—α与其受体TNF—R1结合的关键作用区域位于Leu145至Ser152之间。
第2章优选多肽对于TNF-α激活的HeLa细胞中NF-κB通路的影响
目的：研究优选多肽Pep3在体外培养的HeLa细胞中对于TNF—α激活的NF—κB通路的影响。
方法：
1.摸索TNF—α刺激HeLa细胞引起IκB—α降解和NF—κBp65亚基核转位的量效和时效关系，建立TNF—α激活NF—κB通路的细胞模型。
2.利用MTT法探索HeLa细胞使用Pep3的安全剂量范围。
3.采用Westernblot、核蛋白提取等方法探讨Pep3对于TNF—α刺激HeLa细胞引起IκB—α降解和NF—κBp65亚基核转位的影响。
结果：
1.与正常组相比，TNF—α(0.6-2.0ng/ml)作用于HeLa细胞(5-40min)能够显著诱导IκB—α降解，并呈一定的时效与量效关系，其中诱导IκB—α降解的最适条件是1.0ng/mlTNF—α刺激30min。
2.与正常组相比，TNF—α(0.5-8.0ng/ml)作用于HeLa细胞(5-40min)能够显著诱导NF—κBp65亚基核转位，并呈一定的时效与量效关系，其中诱导NF—κBp65亚基核转位的最适条件是2.0ng/mlTNF—α刺激30min。
3.Pep3(2.5μM-150μM对于HeLa细胞的细胞活力没有影响(p>0.05vs.对照组)。
4.Pep3(2.5μM，5μMand10μM)与TNF—α预孵育1h后，能够显著抑制TNF—α引起的IκB—α降解，并呈显著的剂量依赖关系。
5.Pep3(10μMand20μM)与TNF—α预孵育1h后，能够显著抑制TNF—α引起的NF—κBp65亚基核转位，并呈显著的剂量依赖关系。
结论：在HeLa细胞上成功建立TNF—α激活NF—κB通路的细胞模型。Pep3主要通过抑制TNF—α与其细胞膜上受体的结合，从而浓度依赖性地抑制抑制TNF—α刺激HeLa细胞起的IκB—α降解和NF—κBp65亚基核转位。
第3章优选多肽Pep3对LPS诱导RAW264.7细胞释放炎症因子的影响
目的：评价优选肽Pep3对细菌脂多糖(LPS)刺激小鼠RAW264.7细胞释放炎症因子的影响。
方法：
1.体外培养小鼠RAW264.7细胞，LPS刺激小鼠RAW264.7细胞分泌TNF—α和IL—6。
2.利用MTT法探索HeLa细胞使用Pep3的安全剂量范围。
3.ELISA法检测不同浓度Pep3对于LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放TNF—α和IL—6的影响。
结果：
1.与正常组相比，LPS(100ng/ml)刺激小鼠RAW264.7细胞(30min—6h)所分泌的TNF—α和IL—6均时间依赖性地增加。
2.本实验中涉及的Pep3的浓度(2.5μM—50μM)对于小鼠RAW264.7细胞的细胞活力没有影响(p>0.05vs.对照组)，均为适用于小鼠RAW264.7细胞的安全浓度。
3.Pep3(10μM，20μMand40μM)可抑制LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放TNF—α和IL—6，并呈一定的剂量依赖关系。
结论：成功建立LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放炎症因子的细胞模型。Pep3主要通过抑制细胞上清中TNF—α的活性，从而浓度依赖性地抑制抑制LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6。
第4章优选肽Pep3对GalN/LPS致小鼠急性肝损伤的保护作用
目的：体内评价优选肽Pep3对D-氨基半乳糖(GalN)与细菌脂多糖(LPS)共处理引起小鼠急性肝损伤的保护作用。
方法：
1.选用雄性昆明小鼠，以GalN1000mg/kg、LPS100μg/kg腹腔内一次注射制备急性肝损伤模型。
2.治疗组于GalN/LPS共处理前30min和处理后30min分别经腹腔注射给予Pep3(20mg/kgand10mg/kg)。
3.于GalN/LPS共处理1h后摘眼球取血，检测血清中TNF-α的水平。
4.于GalN/LPS共处理6h后剖杀动物测定肝脏组织匀浆，检测超氧化物歧化酶(SOD)活性，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性及丙二醛(MDA)含量变化；并取肝脏组织做病理切片检查。
结论：成功建立GalN/LPS引起小鼠急性肝损伤模型，Pep3通过抑制血清中TNF—α的活性，从而对GalN/LPS引起的昆明小鼠急性肝损伤有保护作用。