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由病毒、细菌等病原微生物侵染动物所引起的各种传染性疾病严重制约了各个国家和地区养殖业的健康发展,同时也对人类健康存在着巨大隐患。因此,对动物传染性疾病的防治措施研究具有重大的经济价值和社会意义。疫苗免疫是当前预防和控制传染性疾病的主要措施,但目前使用的常规疫苗并不理想,存在免疫效率低与安全性差的两大难题。因此,如何在安全剂量疫苗接种下提高动物机体的免疫力,成为当今世界疫苗开发研究的热点之一。 细胞因子是由免疫效应细胞和相关细胞产生的,具有多种生物学活性的细胞调节蛋白。它在免疫应答的产生和调节中具有重要作用,可作为新一代免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。二十多年来,各国学者致力于细胞因子重组蛋白作为疫苗佐剂研究,取得了许多振奋人心的结果:多种细胞因子重组蛋白包括IL、IFN、TNF、GM-CSF等,均能在不同程度上增加常规疫苗,包括灭活苗、弱毒苗、亚单位疫苗等的免疫效应。近年来,将细胞因子基因作为DNA疫苗佐剂,由于其简便性与有效性,亦受到了人们愈来愈多的关注与重视。 鉴于此,本研究以猪白细胞介素2(pIL-2)与猪白细胞介素6(pIL-6)为研究对象,开展了这两种细胞因子以及他们的融合蛋白(pIL6-IL2)以重组蛋白的形式对常规疫苗PRV灭活疫苗的佐剂效应研究,及以基因形式对PRRSV ORF5核酸疫苗的佐剂效应研究。主要研究内容包括: 1.pIL-2、pIL-6及pIL6-IL2的原核表达及纯化 构建pIL-2、plL-6及pIL6-IL2原核表达载体,均在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达。其中rpIL-2包含信号肽序列,rpIL-6不含信号肽序列,rpIL6-IL2由一段亲水性、低电荷效应的Linker连接均不含信号肽的pIL-6与pIL-2分子组成。三种原核表达产物均以包涵体形式产生,因此通过提取包涵体—SKL变性—透析复性的生化提纯步骤来获取有生物学活性的重组蛋白。另将提纯了的原核表达产物rpIL-2、rpIL-6免疫家兔制备多克隆抗体。 2.19IL-2、pIL-6及pIL6-IL2的酵母表达及纯化 构建pIL-2、pIL-6及pIL6-IL2酵母表达载体,在P.pastoris GS115菌株获得分泌型表达。对3种酵母表达产物分别进行了Western blot检测,验证为目的蛋白。通过N端糖基化分析,发现酵母表达产物rpIL-2带有约5kDa的N端糖链,rpIL-6无N端糖基化修饰,rpIL6-IL2则以有糖链、无糖链两种分子状态存在,之间相差约2kDa;采用硫酸铵沉淀—PBS盐析—PEG20000浓缩的纯化办法,除去培养基中的毒性成分。对3种重组酵母菌进行了分泌外源蛋白最佳诱导时间及菌株持续稳定表达情况分析,验证诱导培养第4、5天外源蛋白分泌量最高;只需保持一定的酵母生长浓度,重组酵母菌可持续培养,稳定表达外源蛋白。提纯的酵母表达产物冻干活