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植物角质层蜡质具有多种生理和生态功能,是植物抵御外界环境胁迫的第一道屏障。角质层蜡质主要由超长链脂肪酸、烷类、醛类、酸类、醇类、酮类和酯类等组成。脂肪酰-CoA还原酶(fatty acyl-CoA reductase,FAR)负责催化蜡质组分一级醇类的合成。本研究分离克隆了甘蓝型油菜FAR基因BnCER4-1、BnCER4-2、BnCER4-3、BnCER4-4,并对它们进行了生物信息学分析;研究了BnCER4家族成员的组织器官特异性表达以及激素诱导表达模式;比较了它们在有蜡粉、无蜡粉材料中的差异表达;构建了BnCER4-4的超表达载体和RNAi载体,为进一步转基因功能研究奠定了基础。主要结果如下:1.甘蓝型油菜脂肪酰-CoA还原酶BnCER4基因成员的克隆和序列分析利用电子克隆与RT-PCR技术获得了甘蓝型油菜FAR基因的四个ORF序列,分别命名为:BnCER4-1(基因登录号:KT795333)、BnCER4-2(基因登录号:KT795334)、BnCER4-3(基因登录号:KT795335)、BnCER4-4(基因登录号:KT795336)。其中BnCER4-1与BnCER4-2的ORF(包括终止密码子)为1479 bp,编码492个氨基酸残基,而BnCER4-3与BnCER4-4的ORF为1482 bp,编码493个氨基酸残基。BnCER4-1、BnCER4-2、BnCER4-3、BnCER4-4的GC含量分别是41.58%、41.58%、41.36%、41.50%。BLASTn、氨基酸序列多重比对表明这4个基因与预测的白菜、甘蓝的FAR基因同源性最高,其次是拟南芥、亚麻荠。预测的四个基因前体蛋白二级结构主要是α-螺旋(38.62%-42.39%),无规则卷曲(25.20%-26.17%)和延伸链(21.91%-25%)较少,β转角(9.53%-10.77%)比例最低。亚细胞定位发现BnCER4-1、BnCER4-2、BnCER4-3和BnCER4-4均可能位于叶绿体。预测的四个前体蛋白在N端都有一个结合NAD(P)H的Rossmann折叠结构域,并含有保守序列GXXGXX(G/A)及YXXXK,在C端有一个脂肪酰CoA还原酶结构域,符合植物FAR蛋白结构特征。2.BnCER4基因家族的表达分析qRT-PCR检测结果表明,甘蓝型油菜BnCER4家族成员表达存在组织器官特异性。BnCER4-1/2在叶片中的表达量最高,其次是茎,在角果和花中表达量较低,而在根中几乎不表达。BnCER4-3/4也是在叶片中表达量最高,其次是角果、茎、花,其中BnCER4-3在根中不表达,BnCER4-4在根中有少量表达。这表明BnCER4的几个家族成员可能活跃地参与了甘蓝型油菜地上部分组织器官角质层蜡质的沉积,其中BnCER4-1/2在叶片的蜡质沉积中起主要作用,而BnCER4-3/4可能普遍参与了地上部分组织器官的蜡质合成。对BnCER4家族成员在有蜡粉与无蜡粉材料茎、叶中的差异表达分析结果表明,BnCER4-1/2在中双11和无蜡粉材料茎中的表达无显著差异,而BnCER4-3/4在中双11茎中的表达显著高于无蜡粉材料。BnCER4-1/2与BnCER4-3/4在无蜡粉材料叶片中的表达量均显著下调,其中BnCER4-4在无蜡粉材料的叶片中不表达。这表明植株蜡质沉积的减少与BnCER4家族成员的转录下调有关。外源激素SA、MeJA及ACC处理不同程度地诱导了BnCER4-1/2在甘蓝型油菜中双9与渝油19中的表达。3.Bn CER4-4超表达载体与RNAi载体的构建设计了带有SacI/Xma I酶切位点序列的PCR引物,从油菜总cDNA中扩增获得BnCER4-4的全长编码序列,经测序验证正确后,利用Xma I+SacI双酶切技术将编码序列最终克隆到pCambia2301G载体上,得到了携带目的基因的重组载体pCambia2301G-BCER4-4,依次转化大肠杆菌DH5α及根癌农杆菌LBA4404,经过PCR及酶切鉴定后获得了携带BnCER4-4的工程菌株。根据BnCER4-3/4的保守区域设计RNAi片段引物,克隆了284 bp的甘蓝型油菜BnCER4-3/4基因家族特异的RNA干扰片段,利用NcoI+Aat II双酶切将反义片段亚克隆到植物RNA干扰基础载体pFGC5941M的启动子与间隔区之间,利用BamHI+XbaI双酶切将正义片段亚克隆到pFGC594lM的间隔区与终止子之间,形成RNA干扰载体pFGC5941M-BCER4I,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,依次转化大肠杆菌DH5α及根癌农杆菌LBA4404,获得工程菌株。