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为了深入了解磷脂酰胆碱的生物学功能,探讨其是否与细菌致病性相关,本研究通过建立在大肠杆菌细胞膜中表达磷脂酰胆碱并部分替代磷脂酰乙醇胺的试验菌株来探讨磷脂酰胆碱与细菌表面抗原存在的一定相关性。本课题主要做了如下几方面的研究。
1、E.coli Top10pcs+试验菌株与对照菌株的构建
从已构建的表达载体pET23a-pcs上扩增出带有组氨酸标记的pcs基因并克隆到表达载体ptac85-pcs,将其转化大肠杆菌E.coli Top10筛选得到重组子E.coli Top10pcs+。同时构建不含pcs基因的对照菌株E.coli Top10/ptac85。经TLC鉴定,E.coli Top10pcs+中合成产物PC,而对照Ecoli Top10/ptac85不合成PC。为了优化PC的表达量,我们通过调节IPTG与胆碱的使用浓度以及诱导时间来优化。试验表明,当细菌的OD600达到0.6-0.9时加入0.5 mmol/LIPTG进行诱导,加入1.0％胆碱,37℃诱导培养4-8小时,磷脂酰胆碱(PC)的合成量达到最高,可以占到大肠杆菌细胞膜磷脂组分的30％左右。
2、试验菌株与对照菌株脂多糖(LPS)之间的差异比较
通过使用改进的酚水法抽提E.coli Top10pcs+和E.coli Top10/ptac85的脂多糖(LPS),电泳分离银染后发现,对照菌株与E.coli Top10 pcs+菌株之间LPS电泳带存在着明显差异,主要表现在25KD,14.4KD到18.4KD之间。将E.coli Top10pcs+和E.coli Top10/ptac85灭活后分别免疫新西兰大白兔后制备得到免疫血清,将免疫血清与两种LPS分别进行Western-blot杂交。结果显示:E.coli Top10/ptac85的免疫血清分别与E.coli Top10/ptac85的LPS、E.coli Top10pcs+的LPS杂交,在分子量为18.4 KD-30 KD杂交带颜色较深,而E.coli Top10 pcs+的免疫血清分别与E.coli Top10pcs+的LPS、E.coli Top10/ptac85的LPS杂交,分子量为14.4 KD-18.4 KD的杂交带颜色较深。Western-blot的结果提示含有PC和不含PC细菌之间的免疫原性有一定差异。
3、试验菌株与对照菌株感染小鼠后体重及腹腔内巨噬细胞数量的变化
将E.coli Top10 pcs+和E.coli Top10/ptac85分别接种小鼠腹腔感染小鼠,比较小鼠感染后的体重变化及腹腔内巨噬细胞的数量变化。结果显示：在感染后的前36小时,被E.coli Top10/ptac85感染的小鼠体重明显减轻,而被E.coil Top10pcs+感染的小鼠体重则缓慢增加；被E.coli Top10/ptac85感染后小鼠腹腔内诱导巨噬细胞的数量明显多,而E.coli Top10 pcs+诱导的巨噬细胞则较少。但是在感染后期,E.coli Top10/ptac85和E.coliTop10 pcs+感染的小鼠体重都缓慢增加,且腹腔内吸引巨噬细胞的数量差异不大。结果提示由于PC在细菌细胞膜中的掺入,使细菌在感染前期更容易在小鼠腹腔内存活。综上所述,在细菌细胞膜中掺入PC,不仅使细菌的免疫原性发生了改变,而且还能在感染前期通过一定方式减少对巨噬细胞的吸引来增加细菌在体内的存活率。