【摘 要】
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研究目的:本课题将与TNFR1受体特异性结合的核酸适配体Apt2-55和靶向前配体组装结构域（PLAD）的抗炎活性肽Pep4-19修饰到DNA四面体（TD）上,以制备两种空间结构不同的复合核酸纳米药物,通过体内外研究,综合评价其抗炎活性。研究方法:ssDNA链在适宜的缓冲盐浓度和程序性降温下,按照碱基互补配对原则自组装形成DNA四面体结构;与TNFR1受体特异性结合的核酸适配体Apt2-55通过延
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研究目的:本课题将与TNFR1受体特异性结合的核酸适配体Apt2-55和靶向前配体组装结构域（PLAD）的抗炎活性肽Pep4-19修饰到DNA四面体（TD）上,以制备两种空间结构不同的复合核酸纳米药物,通过体内外研究,综合评价其抗炎活性。研究方法:ssDNA链在适宜的缓冲盐浓度和程序性降温下,按照碱基互补配对原则自组装形成DNA四面体结构;与TNFR1受体特异性结合的核酸适配体Apt2-55通过延长链的碱基互补配修饰到TD上制备TD-A;靶向PLAD的抗炎活性肽Pep4-19首先通过交联剂Sulfo-SMCC的作用与氨基修饰的ss DNA1或ss DNA2-Apt2-55偶联,制备多肽-DNA复合物,再通过碱基互补配对修饰到TD上,得具有不同空间结构、双靶向于TNFR1的复合核酸纳米药物TD-3A-3P和TD-3（A-P）。利用琼脂糖凝胶电泳、尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE电泳等实验和纳米粒度电位分析仪、透射电子显微镜（TEM）等仪器对复合核酸纳米药物的结构和稳定性进行表征。在体外抗炎活性评价中,通过CCK 8实验考察TD-3A-3P和TD-3（A-P）对炎性L929细胞活力的影响,初步评价其抗炎效果;在抗炎机制研究中,利用流式细胞术考察复合核酸纳米药物对炎性L929细胞凋亡的影响;通过Caspase-3酶活性检测考察细胞凋亡中关键酶活性的变化;利用Western Blot实验考察TNFα诱导的p-IκB蛋白的表达量。通过划痕实验、Transwell迁移实验、ELISA实验研究复合核酸纳米药物对滑膜成纤维细胞（FLS）迁移和炎症因子表达的影响。利用激光共聚焦显微镜考察细胞对复合核酸纳米药物的摄取。在体内抗炎活性评价中,通过两次免疫法建立胶原诱导的关节炎（CIA）小鼠模型,通过尾静脉注射和微针给药两种方式进行治疗。给药治疗中考察小鼠脚掌厚度、足趾体积、临床评分等指标,治疗结束后观察小鼠关节的H＆E染色切片、番红-固绿染色切片和Micro-CT结果,并测定小鼠血清中炎症因子的水平,综合评价复合核酸纳米药物的体内抗炎效果。研究结果:本课题成功的制备了两种具有不同空间结构的复合核酸纳米药物TD-3A-3P和TD-3（A-P）。琼脂糖凝胶电泳结果初步表明TD合成成功,DLS结果和TEM图进一步验证了TD的尺寸和形态。SDS-PAGE电泳、尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等结果表明TD-3A-3P和TD-3（A-P）成功合成。在体外抗炎活性评价中,CCK 8实验结果表明TD-3A-3P和TD-3（A-P）均能提高炎性L929细胞的存活率,具有良好的抗炎活性。进一步的机制研究表明,TD-3A-3P和TD-3（A-P）能够抑制炎性L929细胞的凋亡、降低细胞凋亡中关键酶Caspase-3的活性、抑制TNFα诱导的p-IκB蛋白的表达。划痕实验、Transwell迁移实验、ELISA实验结果表明,TD-3A-3P能够在一定程度上抑制FLS细胞的迁移和炎症因子IL 6的表达,体外抗炎效果优于TD-3（A-P）。体内抗炎活性研究表明,TD-3A-3P能够明显改善CIA小鼠脚掌的肿胀程度、降低小鼠的临床评分,给药治疗后小鼠的关节腔变宽、软骨相对完整、骨侵蚀程度降低、血清中炎症因子水平降低,且尾静脉注射的抗炎活性高于微针给药。血常规和内脏H＆E染色结果表明TD-3A-3P在小鼠体内无明显的毒性。实验结论:本课题成功制备了两种复合核酸纳米药物TD-3A-3P和TD-3（A-P）,其中TD-3A-3P在体内和体外均具有较好的抗炎效果,为靶向TNFR1受体治疗类风湿性关节炎的研究提供了新的思路和方法。
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