胚胎干细胞(ESCs)一般由胚胎的内细胞团分离而来,具有无限增殖和多向分化潜能,但人类ESCs的分离由于需要损坏早期胚胎,受到法律和伦理道德的约束。最近,应用几种转录因子诱导小鼠体细胞转变为诱导型多能干细胞(iPSCs)获得成功,这种iPS细胞与小鼠ES细胞在形态、增殖、基因表达和体内外分化等方面基本一致。人类体细胞随后也被成功诱导为iPS细胞,这种方法不需要破坏人类胚胎,这些人类iPS细胞可分化为患者自体的各种细胞,在细胞治疗和再生医学方面具有重大意义。之后,猕猴、大鼠、猪等物种也得到iPS细胞。动物iPS细胞除可用于建立动物疾病模型和药物筛选等医学领域,对于家畜遗传育种和基因改良等畜牧业生产亦意义重大,但牛iPS细胞的诱导研究迄今未见报道。本试验应用人和小鼠诱导iPS细胞的方法,将几种转录因子通过反转录病毒载体导入牛体细胞,诱导产生牛iPS细胞,并对其特性加以检测。经过试验,取得了如下结果：(1)本试验成功地从胎牛原始生殖嵴中克隆出963 bp的牛sox2基因开放阅读框序列,与发表的牛sox2基因序列(NM-001105463)比对,其核苷酸同源性为99.6%,对应氨基酸同源性为99.7%；以生长接触抑制的胎牛肾上皮细胞(MDBK)为材料,克隆出1434bp的牛Klf4基因开放阅读框序列,经测序并与发表的牛Klf4基因序列(NM-001105385)比对,其核苷酸与对应氨基酸序列同源性达99.9%。(2)将基因片段插入反转录病毒载体pMSCVneo,成功构建pMSCV-sox2 (pMS)和pMSCV-klf4 (pMK)真核表达载体。将pMS和pMK分别转染包装细胞PT67,分布得到稳定的产毒细胞株,MSCV-sox2病毒滴度达8.16×107CFU/mL, MSCV-klf4病毒滴度达7.16×107CFU/mL。电镜下观察病毒上清,可看到典型的反转录病毒颗粒形态。(3)本试验应用四转录因子组合Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4,以反转录病毒载体为介导,诱导新生奶公牛成纤维细胞(NBF),以人羊膜(HAM)为饲养层,成功得到ESCs样的细胞集落,诱导所得到的细胞被命名为iPS-NBF细胞。(4)牛iPS-NBF细胞AKP染色阳性,Nanog、Oct4、Sox2、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、TERT的免疫荧光染色阳性,而SSEA-1免疫荧光染色为阴性。经实时定量PCR分析,牛iPS-NBF细胞的有关多能性基因nanog、oct4、sox2已被有效激活,表达量接近牛PGCs。经核型分析发现传代至第15代的牛iPS-NBF细胞仍保持正常的二倍体核型。(5)用类胚体介导方法,牛iPS-NBF细胞自发分化为多种形态的细胞,通过免疫荧光染色和RT-PCR分析,证明牛iPS-NBF细胞在体外可以分化为三个胚层类型的细胞。(6)将牛iPS-NBF细胞注入免疫缺陷鼠皮下成功得到畸胎瘤,HE染色显示,肿瘤包含有中胚层(肌肉、血管、软骨等)和内胚层(内脏上皮)组织,而外胚层组织在切片中未找到。(7)把10-15个牛iPS-NBF细胞注射入小鼠的8-细胞胚或桑椹胚内,成功得到6只成活的牛-鼠嵌合体小鼠,经牛特异性线粒体D-loop序列检测,证实牛iPS-NBF细胞参与了嵌合体小鼠多种组织的发育,包括心脏、血液、肺、胃肠道、胃、肾、神经组织、骨骼肌和性腺等。(8)采用Nanog、Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4和Lin28六个转录因子,以不同的组合(2因子SO；3因子NOS；4因子OSCK和NOSL;5因子NOSKL;6因子NOSCKL)来诱导牛NBF细胞重编程,结果显示,几种组合都可以成功诱导体细胞重编程获得干细胞样集落,与4因子组比较,5因子和6因子组诱导效率显著提高,而2因子和3因子组诱导细胞集落少,且不典型,可能是体细胞未能被完全重编程。