背景:乳腺癌(breast cancer,BC)是女性发病率最高的恶性肿瘤,每13分钟就有1人死于乳腺癌。因此乳腺癌已成为严重危害全球女性健康的重要疾病。其中三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是指不表达雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体(HER2)的乳腺癌,具有高异质性、高发病率、高侵袭性、较高抗药性及易复发转移等特点。因此在个体化治疗和特定靶向治疗的时代深入研究TNBC发生发展机制,寻找有效的治疗靶点和策略一直是该领域的研究热点。TNBC根据分子表型可分为4种亚型:腔面雄激素受体型、免疫调节型、基质样免疫抑制型和间充质干细胞样型。其中腔面雄激素受体型三阴性乳腺癌(LAR TNBC)以雄激素受体(androgen receptor,AR)信号通路活化为特征,AR在促进其发生发展中起至关重要的作用。因此针对LAR TNBC,靶向AR的治疗已成为近年来新的研究热点。AR是配体依赖性转录因子,与雄激素结合后进入细胞核,与特异的DNA部位即雄激素应答元件结合调控靶基因的转录表达。拮抗AR信号通路目前主要有两种策略:(1)雄激素剥夺治疗降低循环中雄激素水平;(2)使用AR拮抗剂直接阻断AR信号通路。这两种策略在早期治疗效果较好,但随着治疗时间的延长会逐渐表现出敏感性降低或反弹性快速增长,究其原因仍然与AR密切相关,主要表现为AR信号通路的异常活化:AR水平增加或敏感性增强、AR氨基酸突变、产生多种剪接变异体或AR通过配体非依赖的方式进行活化等,导致抗雄激素及抗AR治疗的抵抗。因此有研究明确提出第3种策略,直接减少AR,即通过促进AR降解或抑制其转录,以从源头靶向拮抗AR信号通路已成为一种新的治疗策略,目前相关药物正在进行临床前研究。因此寻找能直接减少AR表达的药物或途径具有重要意义。内质网是蛋白折叠和修饰的主要场所,未折叠或错误折叠蛋白在内质网聚集将引发内质网应激(ER stress),从而激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。内质网应激可通过UPR启动PKR-样内质网激酶(PKR-like ER kinase,PERK)、肌醇需求型1(inositol requiring 1,IRE1)和激活转录因子-6(activating transcription factor 6,ATF6)通路抑制未折叠蛋白的生成或加速错误折叠蛋白降解,以缓解内质网压力,恢复细胞稳态。但若细胞内存在强烈的或持续的内质网应激反应,将促使UPR过度抑制未折叠蛋白生成和过度降解错误折叠蛋白,反而最终造成细胞死亡。我们课题组前期研究发现内质网应激诱导剂可显著降低前列腺癌LNCaP和C4-2细胞中AR mRNA和蛋白表达。由于乳腺癌与前列腺癌具有广泛的相似性生物学表型,那么诱导内质网应激反应是否也能降低LAR TNBC中AR表达呢?诱导内质网应激反应是否可以用于LAR TNBC治疗呢?方法:一、内质网应激诱导剂对LAR TNBC细胞中AR表达的影响1.采用western blotting检测内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(TG)、布雷非德菌素A(BFA)和衣霉素(TM)对MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR蛋白水平的影响;2.采用real-time PCR检测TG和BFA对MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR mRNA表达的影响;3.采用western blotting检测蛋白合成抑制剂放线菌酮对TG下调MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR蛋白水平的影响;采用real-time PCR检测mRNA合成抑制剂放线菌素D对TG下调MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR mRNA表达的影响。二、内质网应激诱导剂抑制LAR TNBC中AR表达的分子机制研究1.采用western blotting研究PERK抑制剂GSK2656157、IRE1抑制剂4μ8c和ATF6 siRNA对TG下调MDA-MB-453细胞中AR表达的影响;2.采用western blotting研究PERK siRNA、ATF4 siRNA和CHOP siRNA对TG下调MDA-MB-453细胞中AR表达的影响;采用慢病毒过表达ATF4研究高表达的ATF4对MDA-MB-453和CAL-148细胞活力、增殖能力以及AR表达的影响;3.采用ChIP-PCR和DNA测序技术鉴定AR启动子区域是否含有ATF4结合位点;采用双荧光素酶报告实验研究TG和过表达ATF4对AR启动子活性的影响;4.在体内建立过表达ATF4的CAL-148细胞原位移植瘤模型,观察高表达ATF4对肿瘤生长和AR表达的影响;5.采用TCGA数据库分析AR和ATF4在乳腺癌组织中的相关性;采用免疫荧光双染检测TNBC组织芯片中AR和ATF4的表达并分析两者的相关性。三、选择性PERK/eIF2α激活剂对LAR TNBC的作用及机制研究在此部分我们以选择性PERK/eIF2α激活剂CCT020312为研究对象,观察其对LAR TNBC的作用及作用机制。1.采用CCK-8、实时无标记细胞增殖和细胞克隆实验观察CCT020312对MDA-MB-453和CAL-148细胞活力和增殖的影响;2.采用western blotting检测CCT020312对MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、mTOR、p-mTOR、AKT和p-AKT水平的影响;3.采用流式细胞术观察CCT020312对MDA-MB-453和CAL-148细胞周期和凋亡的影响;采用western blotting检测CCT020312对凋亡相关蛋白cleaved PARP、Bax和Bcl-2以及周期相关蛋白CDK4、CDK6和Cyclin D1水平的影响;采用RNAi敲低CHOP,再次观察CCT020312对凋亡的影响;4.在体内建立MDA-MB-453细胞原位移植瘤模型,观察CCT020312对肿瘤生长、AR、CDK4、CDK6、PERK/eIF2α通路和AKT/mTOR中关键分子表达的影响。结果:一、内质网应激诱导剂下调LAR TNBC细胞中AR表达1.在蛋白层面,3种内质网应激诱导剂TG、BFA和TM均能显著升高MDA-MB-453细胞中内质网应激反应标志分子Bip、CHOP、ATF4和XBP1s水平,显著降低AR的蛋白水平;2.在mRNA层面,TG和BFA也呈时间和剂量依赖性的显著降低MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR mRNA表达(P<0.05或P<0.01);3.与单独的放线菌酮组比较,放线菌酮联合TG处理组并没有明显降低MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR蛋白水平;与单独的放线菌素D组比较,放线菌素D联合TG处理组也没有明显降低细胞中ARmRNA表达。以上结果表明,TG并不促进LAR TNBC细胞中AR蛋白和mRNA降解,提示内质网应激诱导剂是从转录水平抑制AR表达。二、内质网应激诱导剂通过PERK/eIF2α/ATF4通路抑制AR转录1.内质网应激信号通路IRE1、ATF6和PERK对TG下调AR表达的影响。(1)与单独的IRE1抑制剂4μ8c组比较,4μ8c联合TG处理组可显著降低MDA-MB-453细胞中AR水平;(2)与ATF6siRNA+DMSO组比较,ATF6 siRNA+TG处理组可显著降低MDA-MB-453细胞中AR水平;(3)与单独的PERK抑制剂GSK2656157组比较,GSK2656157联合TG处理组不能显著降低MDA-MB-453细胞中AR水平。以上结果表明,诱导内质网应激可能通过PERK通路而不是IRE1和ATF6通路下调AR表达。2.干扰或过表达PERK、ATF4和CHOP对TG下调AR表达的影响。(1)PERK siRNA可显著逆转TG引起的MDA-MB-453细胞中AR下调;(2)ATF4 siRNA也可显著逆转TG引起的MDA-MB-453细胞中AR下调;(3)CHOP siRNA对TG引起的MDA-MB-453细胞中AR下调无明显影响;(4)过表达ATF4可显著升高MDA-MB-453和CAL-148细胞中ATF4和CHOP表达,显著下调AR表达;过表达ATF4也可显著降低CAL-148细胞活力和增殖能力(P<0.05或P<0.01)。以上结果表明,诱导内质网应激通过PERK/eIF2α/ATF4通路下调AR表达。3.AR基因调控序列上含有ATF4结合位点,结合位点分别位于AR启动子区域的-2813~-2486、-2084~-1742、-1453~-1254;TG可促进ATF4与AR启动子结合并显著降低AR启动子活性,过表达ATF4也可显著降低AR启动子活性(P<0.05或P<0.01)。以上结果初步表明,诱导内质网应激反应可负调控AR的转录。4.体内实验也进一步证实过表达ATF4可显著抑制CAL-148细胞原位移植瘤的生长(P<0.05)和下调AR水平。5.来自TCGA数据库中的结果表明ATF4与AR在乳腺癌组织中呈负相关(P<0.01);人TNBC组织芯片结果表明ATF4与AR在三阴性乳腺癌组织中呈负相关,但由于样本量太少而无统计学差异。三、选择性PERK/eIF2α激活剂抑制LAR TNBC的作用及分子机制研究1.体外研究(1)选择性PERK/eIF2α激活剂CCT020312可显著抑制MDA-MB-453和CAL-148细胞增殖(P<0.05或P<0.01)。(2)CCT020312可显著诱导MDA-MB-453和CAL-148细胞凋亡(P<0.05或P<0.01);显著升高cleaved PARP和促凋亡蛋白Bax水平以及明显降低抗凋亡蛋白Bcl-2水平;RNAi敲低CHOP可显著逆转CCT020312诱导的cleaved PARP和Bax水平升高。以上结果表明CCT020312可诱导LAR TNBC细胞凋亡。(3)CCT020312可显著诱导MDA-MB-453和CAL-148细胞G1期阻滞;显著抑制G1期关键蛋白CDK4、CDK6和CyclinD1水平。以上结果表明CCT020312可诱导LAR TNBC细胞G1期阻滞。(4)CCT020312可显著升高PERK、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP水平,明显降低AR、p-AKT和p-mTOR水平。2.体内研究(1)CCT020312可显著抑制MDA-MB-453细胞原位移植瘤的生长(P<0.05),但对裸鼠体重无明显影响。(2)CCT020312可显著升高p-eIF2α、ATF4和CHOP水平;CCT020312可显著降低AR、CDK4、CDK6、p-mTOR和p-AKT水平。结论:1.诱导内质网应激可从转录水平下调AR表达;2.诱导内质网应激通过激活PERK/eIF2α通路促进ATF4与AR启动子结合,从而抑制AR的转录活性;3.选择性PERK/eIF2α激活剂CCT020312在体内外均可显著抑制LAR TNBC,其机制与激活PERK/eIF2α通路抑制AR、诱导细胞凋亡和G1期阻滞以及抑制AKT/mTOR通路密切相关;以上研究结果表明,靶向激活内质网应激特定信号通路可为LAR TNBC的治疗提供新的策略和思路。通过本项目的研究也为其他基于内质网应激理论的药物研发提供理论参考。