亲和层析是一种利用固定相与目标组分间的特异性亲和力而实现对目标组分的分离和纯化的液相色谱技术。细胞膜色谱是近年来发展迅速的一种生物亲和层析技术,其以细胞膜和色谱载体为固定相,通过色谱分析在体外模拟药物与细胞膜受体之间的相互作用。本课题组在前期的工作中在细胞膜色谱的原理和方法的基础上发展了脂筏亲和色谱。脂筏是膜脂双层结构内的微区域,富含特殊脂质和蛋白质。利用脂筏中富含的受体与药物的相互作用,可以实现对中药活性部位快速、有效的在线筛选。P-糖蛋白(P-gp)作为细胞膜上与药物转运相关的具有重要功能的转运蛋白,定位于脂筏区域内。P-gp通过ATP依赖性的方式将化疗药物排出细胞外,从而影响化疗药物在细胞内的蓄积。因此,P-gp抑制剂可通过逆转多药耐药从而提高药物对肿瘤的化疗效果。在寻找新一代化疗增敏剂的过程中,来源于天然药物的P-gp抑制剂受到研究界的关注。传统的用于P-gp抑制剂的筛选模型是Caco-2细胞单层模型,但该模型存在实验周期长、无法进行高通量筛选等缺点。本文在课题组前期工作的基础上,构建富含P-gp的脂筏色谱筛选模型,考察脂筏色谱的保留特性;在此基础上,采用pH梯度结合溶剂浮选法提取分离大黄中蒽醌类活性成分,优化提取工艺并考察不同浮选部位在脂筏色谱柱上的保留;采用双水相萃取法提取分离人参皂苷活性成分,响应面法对萃取工艺进行优化,考察人参萃取部位在脂筏色谱上的保留行为;采用超声辅助溶剂萃取法得到杨梅叶粗提物,考察杨梅叶粗提物及其黄酮化合物在脂筏色谱柱上的保留行为。本文应用构建的富含P-gp的脂筏亲和色谱筛选模型,进行了多种天然药物中P-gp底物或抑制剂的活性部位的筛选,为天然药物的现代化开发提供有益思考。第一章综述本章主要对P-gp和亲和色谱进行概述。首先对P-gp的结构、分布和生理功能进行归纳概括;同时对P-gp抑制剂的研究进展进行阐述,介绍了P-gp抑制剂的分类、筛选方法以及P-gp的天然产物抑制剂;然后对亲和色谱的机制和分类进行概述;最后归纳总结了亲和色谱在中药活性成分筛选应用中的研究现状,为脂筏色谱筛选模型的构建提供依据。第二章脂筏色谱筛选模型的构建本章进行了Caco-2细胞的培养和扩增,采用非离子型去垢剂法进行细胞抽提,蔗糖密度梯度离心后收集得到富含P-gp的脂筏。通过Western blot和免疫荧光标记法对脂筏中的特征蛋白进行表征。将富含P-gp的脂筏和-NHS修饰的硅胶结合作为脂筏色谱柱的固定相,通过低压湿法进行色谱柱的填装。以维拉帕米作为阳性药,吡嗪酰胺为阴性药来考察脂筏色谱的保留特性。结果表明,采用非离子型去垢剂法可以成功从Caco-2细胞中提取脂筏。构建的富含P-gp脂筏修饰的硅胶色谱固定相可以与以P-gp为靶点的药物特异性结合而产生明显的保留行为。本章构建的基于P-gp调控的脂筏色谱筛选模型,为从天然药物中在线、快速地对P-gp底物或抑制剂进行高通量筛选奠定基础。第三章基于脂筏色谱的大黄活性成分在线筛选本章采用pH梯度结合溶剂浮选法对大黄中的蒽醌类活性成分进行分离富集。将得到的大黄浮选部位通过前期构建的脂筏色谱模型筛选出潜在的大黄活性成分,通过单因素实验优化浮选工艺;MTT法和罗丹明-123(Rho-123)蓄积实验进行P-gp功能的体外初步评价。脂筏色谱筛选结果表明,浮选部位Ⅲ在脂筏柱上有较明显的保留行为,推断含有P-gp的底物或抑制剂。采用单因素实验对浮选部位Ⅲ的主成分大黄素进行浮选条件的优化,得到最佳的工艺条件为乙酸乙酯作为浮选溶剂,浮选时间50 min,离子浓度0.4 mol/L,体系pH 7.8以及气体流速20 mL/min。P-gp功能的体外初步评价结果表明,脂筏柱筛选出的大黄浮选部位Ⅲ可明显增加细胞内Rho-123的蓄积量,具有抑制P-gp的功能,进一步验证了实验前期构建的P-gp脂筏色谱高通量筛选模型具有切实可行性。第四章双水相萃取人参总皂苷及其脂筏色谱在线筛选本章采用乙醇-硫酸铵双水相体系萃取法对人参中总皂苷进行提取,通过Box-Behnken Design响应面法对人参皂苷的提取工艺进行优化,并将得到的人参皂苷萃取部位在前期构建的脂筏色谱进行P-gp功能筛选。最佳萃取工艺为:22.82%硫酸铵,31.64%乙醇,体系pH值为6.9,温度为室温。脂筏色谱筛选结果表明,人参皂苷萃取部位含有P-gp底物或抑制剂。萃取部位中含有人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re等,经过脂筏色谱的筛选发现人参皂苷Rb1在脂筏柱有明显保留,因此人参皂苷Rb1可能是P-gp底物或抑制剂。第五章杨梅叶中黄酮化合物的脂筏色谱在线筛选本章在前期成功构建的P-gp脂筏色谱筛选模型的基础上,对超声辅助溶剂萃取法得到的杨梅叶粗提物和黄酮类化合物进行脂筏色谱柱的分离;同时,实验建立了一种DPPH-HPLC在线筛选抗氧化活性成分的方法。脂筏色谱筛选结果表明,杨梅叶粗提物中含有P-gp底物或抑制剂。杨梅叶粗提物中主要含有杨梅素、槲皮素、杨梅苷以及山奈酚等黄酮化合物,发现槲皮素在脂筏柱有明显保留,因此槲皮素可能是P-gp底物或抑制剂。DPPH-HPLC在线筛选结果表明,杨梅叶粗提物中黄酮类成分的抗氧化活性中槲皮素的抗氧化能力最强,其次为杨梅素,且两者的抗氧化能力都强于L-抗坏血酸,而杨梅苷和山奈酚的抗氧化能力较弱。提示Caco-2细胞构建的脂筏色谱筛选出的成分不仅作用于Pgp,还具备其他活性如抗氧化,这种多活性筛选的实现可能与脂筏上富含多种受体、酶等信号通路有关。