菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)热休克蛋白70基因的克隆及表达分析

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菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)是我国重要海产经济贝类之一,在我国的南北海区均有广泛的养殖面积。近年来随着养殖规模的不断扩大,蛤仔养殖业开始频临各种各样的问题,例如抗逆性差、死亡率高、生长缓慢、病害感染等,危害严重时,使大多数养殖单位育苗及养殖失败,造成经济损失惨重,发生病害后,菲律宾蛤仔会出现生长速度迟缓、抗逆性下降等现象。热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是海洋生物普遍存在的抗胁迫蛋白家族,HSP家族中的HSP70是主要的胁迫诱导蛋白,可以受很多外来胁迫条件的诱导,例如温度、重金属、寄生和炎症等。它具有“分子伴侣”、细胞保护以及抵抗凋亡等生物学功能,因此,有关它的研究已成为生命科学领域研究的热点之一。  本实验利用表达序列标签(EST)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了菲律宾蛤仔HSP70的cDNA全长。结果表明,菲律宾蛤仔的HSP70的cDNA全长为2398 bp(含poly A序列),GenBank登陆号为KM280636。其中5’UTR为104 bp,3’UTR为419 bp,编码625个氨基酸。理论等电点(pI)5.36,预测相对分子量68.38kDa。本研究克隆了菲律宾蛤仔的HSP70基因,为进一步深入研究菲律宾蛤仔的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础。  利用实时荧光定量 PCR技术,对HSP70基因在菲律宾蛤仔不同组织(闭壳肌、外套膜、足、鳃、消化腺)的表达情况进行了研究。结果显示,HSP70基因在菲律宾蛤仔不同组织中均有表达,其中鳃表达量最高,显著高于其它检测组织(P<0.05);研究低盐(15)胁迫处理对不同品系蛤仔HSP70表达的影响,结果表明,在普通群体中,HSP70基因表达量分别在12 h和72h达到最高值,接近空白对照(0h)的2倍,然后回落;对于三种不同壳色品系,在低盐胁迫前,三者的HSP70表达量水平基本一致。胁迫后,96h内的各时间点(3,6,12,24,48,72,96 h),斑马蛤及海洋橙HSP70基因表达量均显著高于白蛤(P<0.05),尤其是斑马蛤,在6h时表达量接近白蛤的2倍。  研究了高温和低温(30℃、-1℃)胁迫处理对不同品系蛤仔 HSP70表达的影响,结果表明,在受到高温胁迫后,蛤仔 HSP70的表达受到显著影响。不同壳色蛤仔表现出相似的趋势:即先升高后降低。但72~96h时,斑马蛤 HSP70的表达出现第二次高峰,其它三种壳色蛤仔表达量均未表现显著变化。低温胁迫后,四种品系蛤仔 HSP70表达量出现不同程度的变化,说明低温也能诱导蛤仔HSP70基因表达。低温时,斑马蛤与海洋橙能够迅速强烈的做出反应,HSP70基因表达在短时间内出现显著变化(P<0.05),但白蛤对低温的反应速度最慢,在48h时HSP70基因表达量才显著升高(P<0.05)。这与各品系冷胁迫的死亡率相对应,死亡率为白蛤(12.90%)>野生群体(3.03%)>斑马蛤(1.49%)>海洋橙(0%)。表明不同壳色品系蛤仔对温度的耐受能力有所不同,且斑马蛤及海洋橙品系较白蛤的耐受性更强。通过不同品系蛤仔的HSP70基因表达量不同,本研究为蛤仔抗逆新品种选育提供理论了及数据支持。
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