论文部分内容阅读
目的:糖尿病患者创伤后创面不易愈合为临床常见问题,其中又以2型糖尿病患者较为多见。本实验通过应用2型糖尿病大鼠模型,探讨外源性GM-CSF对2型糖尿病大鼠创面愈合的影响及其机制。
方法:取2月龄SPF级雌性大鼠70只,体重(200±15)g,在高脂高糖饲料环境下喂养6周后开始造模,造模前禁食12小时,不禁水。STZ用新配制的0.1mmol/L柠檬酸缓冲液(PH=4.2)稀释,大鼠称重后腹腔一次性注射STZ35mg/kg,48小时后血糖平稳时进行血糖监测。选取造模成功的55只大鼠以10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉后背部剃毛,在背部中线靠大腿两侧采用模具各制作直径1.5cm的圆形创面,创面面积约为1.77 cm2。将皮肤沿画线处切开,深至深筋膜下。随机选取造模成功的40只大鼠分为2组:对照组为糖尿病(DM)创面20只,实验组为糖尿病创面+GM-CSF20只(创面注入GM-CSF0.5ug/kg)。另取15只大鼠分为5组,每组3只。A组:DM组;B组:DM+腹腔注射生理盐水组;C组:DM+腹腔注射GM-CSF;D组:DM+局部GM-CSF;E组:DM+局部生理盐水组,大鼠分笼饲养。肉眼观察各组大鼠术后第3、5、8、12、18天创面组织愈合情况,同时每天大鼠称重,在尾静脉抽血监测血糖值。记录每只大鼠的体重、血糖变化及身体状况变化情况。利用透明方格纸沿创面愈合外缘描绘得到第3、5、8、12、18天的创面面积,计算创面愈合率。沿愈合创面外缘超出约1cm切下创面组织,制片后光镜观察创面各类细胞、深层组织愈合情况。取样行透射电镜观察成纤维细胞形态,免疫组化实验观察PCNA,BCL-2阳性细胞。
结果:在各时间点上,注射GM-CSF药物实验组愈合平均面积明显大于对照组。在愈合时间上,实验组平均为19.50±1.29天,对照组为22.00±0.82天。HE染色:实验组第3天创面内存在大量渗出物和大量中性粒细胞等炎性细胞,细胞种类、数量多;对照组细胞数量少,组织结构不清晰。实验组第5天组织结构较清晰,开始存在少量肉芽组织和腺样结构;对照组大量细胞浸润,细胞排列混乱。实验组第8-12天可见大量成纤维细胞,出现胶原束和皮肤结构,组织分层愈合良好,出现上皮层和结缔组织层,可见大量毛细血管和少量腺体生成;对照组第8-12天成纤维细胞数量较实验组少,存在少量炎性细胞,组织结构不清晰。18天时两组创面基本愈合,细胞种类减少,存在大量胶原束,毛细血管增多,基本恢复表皮结构;实验组表皮结构较为光滑。透射电镜观察:实验组15000倍下可见成纤维细胞体积较大,形态完好,周围胶原分泌丰富(图3);40000倍下可见细胞内容物丰富,胞内大量内质网和核糖体,线粒体数量多、体积大,成纤维细胞无水肿、破裂情况(图4)。对照组15000倍下成纤维细胞胶原分泌少,细胞内有水肿(图5);40000倍下可见粗面内质网数量明显减少,内质网显著扩张,细胞内容物少,出现水肿囊泡化,粗面内质网上的核糖体数量少,线粒体数量较实验组少,部分线粒体模糊不清(图6)。PCNA免疫组化结果:第3、5、8、12、18天时,实验组PCNA阳性表达平均值高于对照组,第3、5、8天阳性表达率显著高于后三个时间点。统计学检验证实第5、8天时实验组与对照组之间阳性表达率P<0.05,第3、12天时P<0.01,均具有统计学意义。BCL-2免疫组化结果:对照组第3、5、8、12天时阳性表达低于实验组。在创面愈合过程中BCL-2表达在第3-8天最为明显,第5天时达到峰值。实验组第5天时的BCL-2阳性表达,远高于对照组及其它各时间点。MMP-2的western blot检测可见A组MMP-2表达量最高;B组表达略低;C组MMP-2量较低;D组为局部创面给予GM-CSF,MMP-2表达极少;E组MMP-2表达略少,与C组表达量相仿。
结论:外源性GM-CSF治疗后,2型糖尿病大鼠创面愈合速度加快,愈合情况良好。GM-CSF治疗具有多靶点作用,包括:通过作用于PCNA间接促进成纤维细胞增殖、加快伤口愈合;激活BCL-2抑制细胞凋亡、抵抗外源性损害;抑制MMP-2对细胞外透明膜的分解作用等。