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研究目的：单核/巨噬细胞是机体固有免疫系统的重要组成部分,作为免疫系统的第一道防线,维持机体内环境的稳态。单核/巨噬细胞是一个具有异质性的群体,根据单核/巨噬细胞表面标记物的差异表达,可分为不同的亚群,且各细胞亚群在疾病的病理过程中发挥着不同的作用。近期有研究显示小鼠机体内单核/巨噬细胞亚群的变化会影响许多心血管疾病的病理进展,提示维持机体单核/巨噬细胞不同亚群的平衡可能是这些疾病治疗的潜在靶点。苯妥英钠(phenytoin,PHT)为非选择性电压门控钠通道(voltage gated sodium channels, VGSCs)阻断剂,早期流行病学研究显示长期服用苯妥英钠的癫痫患者其冠心病的患病率明显低于对照组。传统观点认为VGSCs主要存在于可兴奋细胞中(神经元、心肌和骨骼肌),近年研究显示VGSCs亦存在于巨噬细胞等非可兴奋细胞中,并参与其生物表型的调节。本实验室在近期工作中发现VGSCs在小鼠外周血单核细胞中也有表达。因此,我们提出以下假说,VGSCs参与了单核/巨噬细胞亚群的表型调节,而VGSCs阻断剂苯妥英钠可以通过影响单核/巨噬细胞亚群的平衡,降低炎症反应,继而发挥心血管保护作用。研究内容与方法：第一部分采用免疫磁珠分选技术纯化小鼠外周血Ly6G-CD11b+单核细胞,采用real-time PCR法检测电压门控型钠通道α亚单位(NaV1.1-NaV1.9和NaVX)以及β亚单位(Scnlb-Scn4b)的相对表达丰度；第二部分采用real-timePCR法检测小鼠RAW264.7巨噬细胞系中VGSCs各亚型的表达丰度,确定与单核细胞共表达,且丰度高的VGSCs亚型；随后采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术将特定RNAi质粒转染至RAW264.7细胞,经Hygromycin B筛选后获得低表达特定VGSCs亚型的稳定细胞株。对稳定细胞株进行如下检测：1)Real-time PCR检测干扰效率；2)CCK-8法测定增殖活性；3)流式细胞术检测细胞周期和吞噬能力；4) Transwell法检测细胞迁移能力：5)经脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和白介素4(interleukin-4, IL-4)诱导后,real-timePCR检测巨噬细胞表型偏移相关标志物(M1:iNOS; M2:Arg-1)的mRNA表达水平；6)流式细胞术检测VGSCs特定亚型敲低细胞株及VGSCs阻断剂PHT干预后细胞周期的变化。第三部分以6-8周龄雄性C57BL/6J和ApoE-/-小鼠作为研究对象,随机分为高脂饮食组和正常饮食组,10周后,高脂饮食组再随机分为PHT和生理盐水两个亚组,正常饮食组给予生理盐水,继续喂养4周,分别在10周和14周应用流式细胞术检测外周血单核细胞(Ly6Chi：Ly6G-CD11b+Ly6Chi,Ly6Clo：Ly6G CD11b+Ly6Clo)和主动脉粥样斑块内巨噬细胞不同亚群(Ly6ChiF4/80+:CD45+CD11b+F4/80+Ly6Chi, Ly6CloF4/80+: CD45+CD11b+F4/80+Ly6C10)的比例变化；ELISA法检测各处理组小鼠血浆中甘油三酯和总胆固醇的水平。结果：1)小鼠外周血单核细胞表达的VGSCs亚型有：NaV1.1、NaV1.3、NaV1.4、 NaV1.5、NaV1.6、NaV1.7、NaV1.8、NaV1.9、NaVX、Scnlb、Scn2b、Scn3b和Scn4b；RAW264.7细胞中表达的VGSCs亚基有：NaVl.1、NaV1.3、NaV1.4. NaV1.5、NaV1.6、NaV1.7、NaV1.9和NaVX,且NaV1.4和NaV1.9的表达丰度最高。2)我们以NaV1.4为RNAi靶点,建立低表达NaV1.4的RAW264.7稳定细胞株,real-time PCR法鉴定干扰效率约75%。低表达NaV1.4可以显著降低RAW264.7细胞的吞噬和迁移能力,抑制LPS诱导的M1型巨噬细胞标志物iNOS表达的升高,促进IL-4诱导的M2型巨噬细胞标志物Arg1表达的升高,但对细胞的增殖活性无明显影响。PHT可抑制RAW264.7细胞的增殖活性,并随药物作用时间的延长抑制作用增强。3)高脂饮食可增加外周血Ly6Chi单核细胞亚群和主动脉粥样斑块内Ly6ChiF4/80+巨噬细胞的比例,灌胃给予小鼠PHT和生理盐水4周后,与生理盐水组相比,PHT组Ly6Chi单核细胞亚群和Ly6ChiF4/80+巨噬细胞亚群比例显著降低,而Ly6C1。单核细胞亚群和Ly6Clo4/80+巨噬细胞则呈现相反的变化趋势。4)高脂饮食增加机体总胆固醇和甘油三酯的水平,PHT对机体血脂水平无明显影响。结论：阻断VGSCs能够抑制小鼠巨噬细胞系向M1表型(促炎症)偏移和巨噬细胞的增殖；动物模型显示VGSCs阻断剂能够抑制高脂血症诱导的循环促炎症单核细胞(Ly6Chi)与动脉斑块内促炎症巨噬细胞(Ly6ChiF4/80+)的增加。上述结果提示单核／巨噬细胞VGSCs可能是动脉粥样硬化的干预新靶点。