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黄曲霉毒素（Aflatoxin）在自然界中分布广泛,是迄今发现的真菌毒素中最强致癌物之一,主要污染玉米、花生、大米、高粱等大宗农作物,严重威胁人民的身体健康和生命安全,每年因为黄曲霉毒素超标造成的我国出口农产品食品被各国扣留、退回甚至销毁,给我国造成巨大的经济损失,黄曲霉毒素污染也成为我国农产品质量与食品安全的重大风险隐患。除了从源头上对黄曲霉毒素的产毒真菌（如黄曲霉菌、寄生曲霉菌等）进行生物防控外,同时需要寻求高效、灵敏的检测技术对农作物产后的黄曲霉毒素污染进行监测,防止不安全的农产品流入市场和人们的餐桌,从而保障农产品食品的安全和人们的健康。目前,检测黄曲霉毒素污染的方法,主要有基于色谱分析的理化分析法（如薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法等）和基于抗体、抗原特异性结合反应的免疫分析法（如酶联免疫分析法、免疫层析法、免疫传感器等）。免疫分析法具有灵敏度高、特异性好等优点而得到越来越多的应用,高质量抗体的获得是建立免疫分析法的核心。抗体的发展历经多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三个阶段,基因工程抗体与传统多抗、单抗相比具有制备简便、生产周期短、费用低、遗传信息稳定、便于进行工业化生产和抗体亲和力改造等优势,近年来在食品安全和环境污染物检测领域得到广泛应用。本研究在实验室前期已经获得的黄曲霉毒素单链抗体、抗独特型F（ab’）2抗体及抗独特型纳米抗体的基础上,以羊驼为实验对象,通过免疫后采血构建噬菌体展示纳米抗体库,经过几轮淘选获得能与黄曲霉毒素竞争性结合的重链抗体可变区片段,即VHH抗体,又称纳米抗体。建立黄曲霉毒素噬菌体介导的酶联免疫分析法、基于可溶性纳米抗体介导的酶联免疫分析法,制备纳米抗体免疫亲和柱及建立纳米抗体侧向流式时间分辨荧光免疫分析法。这些方法的建立为黄曲霉毒素基因工程抗体的制备和应用提供了新方向,本研究的主要内容及创新点如下:1.首次构建黄曲霉毒素噬菌体展示纳米抗体库,淘选出特异性纳米抗体噬菌体,建立了基于噬菌体展示纳米抗体的酶联免疫分析方法,并应用于农产品中黄曲霉毒素检测。以AFB1-BSA免疫羊驼,提取羊驼外周血淋巴细胞总RNA,反转录成cDNA后,克隆出重链抗体可变区（VHH）基因片段,将其重组到噬菌粒pComb3X中,电转化大肠杆菌ER2738,扩增后获得库容量大小为2×107 pfu的黄曲霉毒素噬菌体展示纳米抗体库。经过四轮亲和淘选,从中筛选出2种能与AFB1竞争性结合的噬菌体展示纳米抗体phage-Nb26和phage-Nb28。通过优化抗原包被浓度、封闭试剂、反应体系pH值、缓冲液离子强度和最适甲醇浓度,最终确定phage-Nb26对黄曲霉毒素B1的灵敏度(IC50值)为0.317ng/mL,phage-Nb28的灵敏度为1.191ng/mL。以phage-Nb26为研究对象,选取花生、大米、玉米、饲料四种空白样品基质,分别添加AFB1后计算回收率,结果显示样品添加回收率在81.0112.0%之间。采用纳米抗体phage-ELISA与HPLC两种检测手段对同一批污染黄曲霉毒素的样品进行检测和结果比对,结果显示两种方法得出的结果相符合,表明本研究建立的纳米抗体phage-ELISA法能用于黄曲霉毒素污染监测,为其他真菌毒素纳米抗体库的构建及筛选提供技术支持。2.研制出独立于噬菌体表达的纳米抗体,探明了黄曲霉毒素纳米抗体的稳定性,建立了基于可溶性纳米抗体的VHH-ELISA方法,为基因工程抗体应用于真菌毒素免疫分析提供了可能。制备独立于噬菌体表达的纳米抗体,通过正交试验设计优化纳米抗体的表达条件,使其表达量提高了30%左右。通过纳米抗体稳定性研究,并与AFB1单克隆抗体mAb B5比较,结果显示纳米抗体比传统单抗具有更好的热稳定性,更能耐受酸性环境、高离子强度和高浓度有机溶剂。基于纳米抗体的ELISA方法（VHH-ELISA）经条件优化后,结果显示纳米抗体Nb26对AFB1的灵敏度(IC50值)为0.754ng/mL,纳米抗体Nb28对AFB1的灵敏度为1.012ng/mL。利用纳米抗体对高浓度甲醇的耐受性,建立70%甲醇浓度下Nb26的VHH-ELISA标准曲线,选取花生、大米、玉米、饲料四种空白样品基质,70%甲醇提取后建立各基质曲线并与标准曲线比较,结果显示基质曲线与缓冲液标准曲线基本一致。Nb26检测样品的灵敏度为3.45μg/kg,线性范围为1.06115.1μg/kg,AFB1的添加回收试验显示,样品添加回收率在86.3112.0%之间,表明本研究建立的基于纳米抗体VHH-ELISA方法能够应用于黄曲霉毒素的污染监测中。3.首次将纳米抗体作为黄曲霉毒素免疫亲和吸附剂,研制出一种可重复使用的纳米抗体免疫亲和柱,并将其应用于农产品样品前处理净化步骤,实现了免疫亲和柱的高效再生利用。利用抗黄曲霉毒素纳米抗体Nb26制备免疫亲和柱（VHH-IAC）,并与两种黄曲霉毒素单克隆抗体（mAb-1C11和mAb-10C9）免疫亲和柱（mAb-IAC）进行比较。这三种免疫亲和柱对AFB1的吸附解离能力比较结果显示VHH-IAC对AFB1具有更高的解离能力;免疫亲和柱重复利用率结果显示VHH-IAC重复使用10次的回收率都在80%以上,而mAb-IAC的回收率随着重复使用次数增加而急剧下降。将重复使用过15次的VHH-IAC应用于实际样品前处理净化,并与初次使用的商品化mAb-IAC进行比较,结果显示两种方法检测结果相符。表明纳米抗体免疫亲和柱可以作为重复使用的前处理工具,应用于免疫亲和柱联合大型仪器分析方法中对黄曲霉毒素含量的检测。4.首次利用黄曲霉毒素纳米抗体建立侧向流式时间分辨荧光免疫层析分析方法,为基因工程抗体进一步应用于小分子生物毒素快速检测技术提供基础。研制出一种以纳米抗体与氧化铕乳胶微球偶联物作为荧光探针的AFB1时间分辨荧光免疫层析快速检测技术（VHH-TRFIA）。通过优化偶联抗体的用量、缓释液、划线抗原抗体用量、荧光探针稀释倍数、反应时间和最适甲醇浓度等,建立了缓冲液和四种基质（花生、大米、玉米、饲料）的时间分辨荧光免疫层析法标准曲线。该方法在10%甲醇/缓释液中的线性范围为0.150μg/kg,LOD为0.05μg/kg;玉米基质的检测线性范围为0.240μg/kg,LOD为0.06μg/kg;花生基质的检测线性范围为1.050μg/kg,LOD为0.34μg/kg;大米基质的检测线性范围为1.040μg/kg,LOD为0.25μg/kg;饲料基质的检测线性范围为0.540μg/kg,LOD为0.17μg/kg。该方法加标回收率在78.1%92.6%之间。采用该方法与HPLC进行比较,检测样品中黄曲霉毒素含量,结果显示两种方法得出的结果相符。该方法的建立为食品中真菌毒素的快速检测技术提供了新思路,纳米抗体的研究和应用有望更深入开展。