前胡内生菌研究及其对品质的影响

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目的:中药前胡为伞形科植物白花前胡(Peucedanum praeruptorum Dunn)的干燥根,是多年生一次开花植物,(1)探索前胡在整个生长阶段中根内生菌与根际微生物之间的动态变化关系以及抽薹前后的菌种差异;(2)分离培养内生真菌并探索其是否能够产生与前胡有效成分相似的化合物;(3)探索差异菌对前胡品质的影响。方法:(1)以一年生前胡整个生长阶段的样品为研究对象,采用E.Z.N.ATM MagBind Soil DNA Kit试剂盒进行DNA提取,PCR扩增,Mi Seq测序平台测序,所得序列经过质控和过滤,按照相似性对序列进行OTU聚类,随后进行多样性指数分析,物种分类分析,菌群差异分析等一系列统计学和可视化分析前胡内生菌与根际微生物的多样性与差异性;(2)应用组织分离法对前胡根组织的内生真菌分离培养,所得菌株进行分子鉴定;并对菌株次生代谢产物进行提取,应用HPLC和LC/MS技术筛选出含有香豆素成分的菌株。(3)灌根法将含有香豆素成分的差异菌回接至前胡幼苗中,分为高、中、低剂量三个处理组,对照用等量无菌水浇灌。定期统计各试验小区的抽薹率并于采收期采集抽薹前后的样品进行有效成分测定。结果:(1)前胡中根际微生物与内生菌的OTU呈现出正相关的关系,在微生物群落多样性方面,内生真菌与根际真菌在前胡整个生长阶段的变化趋势相反,而内生细菌与根际细菌的变化趋势较为接近。前胡内生菌资源丰富,通过宏基因组学分析发现无论是内生菌还是根际微生物,其抽薹前的OTU均小于抽薹后;抽薹后内生真菌的丰富度上升而多样性下降,内生细菌无差异;抽薹前后根际微生物在群落多样性和丰富度均有显著差异,且均是抽薹前小于抽薹后;前胡抽薹后,链霉菌属(Streptomyces),Massilia,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等有益细菌减少,亚隔包壳属(Didymella),Paraboeremia,链格孢菌(Alternaria),青霉菌(Penicillium),镰刀菌(Fusarium)等内生真菌减少。(2)分离培养获得前胡内生真菌49株,其中抽薹前23株,分为17种,12属;抽薹后26株,分为15种,11属。发酵培养发现49株菌中有17株菌含有香豆素成分,其中有13株菌是抽薹前分离所得,仅4株菌是抽薹后分离所得。其中有4株是优势菌,一株差异显著的菌:Q1-5(Didymella segeticola)。(3)将Q1-5回接至前胡中,统计抽薹率发现相比于对照,低浓度处理组的抽薹率偏低,中浓度处理组的抽薹率偏高。测定白花前胡甲素,白花前胡乙素,白花前胡E素发现,在前胡抽薹前期,中浓度处理组的白花前胡甲素含量较之对照显著降低,低浓度处理组的白花前胡乙素显著降低,中浓度和高浓度处理组的白花前胡E素含量显著降低,不同处理组之间三种香豆素含量总和无显著差异。在前胡抽薹后期,相比于对照,低浓度处理组的白花前胡甲素含量显著升高,中浓度与高浓度处理组的白花前胡E素显著降低,低浓度处理组的三种香豆素含量总和显著升高。结论:(1)白花前胡内生菌主要来源于根际微生物,二者存在较稳定的供给关系,白花前胡抽薹前后内生菌与根际微生物之间存在显著差异;(2)白花前胡含有可产香豆素成分的内生真菌;(3)适宜浓度的差异菌Didymella能够在保证前胡质量的同时提高产量。
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