论文部分内容阅读
狂犬病病毒(Rabies virus，RV)基因组为12Kb的单链负股RNA，编码五种已知结构的蛋白，即核蛋白(NP)、转录酶蛋白(LP)、基质蛋白(MP)、糖蛋白(GP)和磷酸化蛋白(NS)。N蛋白是保守性最高和最稳定的一种蛋白，同时也是诱导特异性B细胞和Th细胞反应的良好抗原。GP是诱导机体产生保护性中和抗体的唯一抗原，能刺激机体产生细胞免疫，是狂犬病毒各蛋白中变异较大的一种蛋白，因此G基因是被用来研究狂犬病毒基因工程苗的首选基因。鉴于狂犬病毒野毒株和各固定毒株之间变异较大，而N蛋白保守性最高，因此本研究将我国狂犬病毒兽用疫苗株(Flury LEP株)的N基因用RT-PCR方法进行扩增、测序，并用原核细胞进行了初步表达。对G蛋白进行克隆、测序，以及与其它毒株进行了序列比较。首先，本研究采用RT-PCR扩增了长度为1353bp的N基因和1575bp的G基因，随后将它们分别克隆至pET-28a(+)载体中，构建了重组质粒PET-N和PET-G。其次，对测序的N和G基因利用生物学软件，与人用疫苗株、当前流行的代表性街毒株及其它固定毒株的同源性进行了对比比较，绘制了进化树。结果表明，我国现在所用的兽用疫苗株(Flury LEP株)N和G的基因序列与GenBank上已发表的Flury LEP完全一致，表明该疫苗株在传代过程中未发生变异，且与现在我国流行的RV野毒株基因序列同源性较高。同时，对N和G基因的抗原性和亲水性指数进行了计算和比较，发现N基因各毒株之间差别很小，而G基因各毒株之间差别较大，尤其是主要抗原位点Ⅲ，LEP333位的精氨酸被甘氨酸替代是LEP株与街毒株在该抗原位点的最主要区别。最后，将鉴定正确的PET-N转入BL21细胞，成功表达NP，并通过实验确定了最佳表达时间和最佳IPTG诱导浓度。对N和G基因进行序列分析有助于对当前我国使用的兽用疫苗株的免疫保护性进行分析，同时也能为我国RV的流行病学研究提供参考依据。对NP进行原核表达为以后能进一步利用重组N蛋白作为诊断抗原，开发出一种能够检测RV抗体的ELISA方法奠定基础。本研究为评价现有兽用疫苗的适应性和有效性及我国新灭活疫苗的毒株选择提供了依据。