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微生物油脂因其具有生产周期短、可连续生产、可规模化利用自然界丰富资源和脂肪酸组成易通过基因工程手段进行改造等特点,是第三代生物柴油重要的原料来源。实验室前期构建了微生物油脂生产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CT14,本课题在此基础上进行系统代谢工程改造,进一步研究和探索微生物油脂合成及调控机制。首先,强化前体之一3-磷酸甘油的供给。C.glutamicum CT14只强化了脂肪酸的供给,大量脂肪酸溢出胞外造成浪费。为了平衡合成甘油三酯(TAG)两种前体物质的供给,减少胞外游离脂肪酸的含量,对前体3-磷酸甘油合成途径进行了调控。涉及到的基因有glpD、gpsA和gpp,通过发酵分析比较单个基因以及三个基因不同串联组合表达对菌株胞内外脂肪酸和微生物油脂合成的影响,获得最优的基因组合改造策略,过表达gpsA并敲除基因glpD,菌株胞外游离脂肪酸基本为零,总脂肪酸产量达到1.8 g/L,甘油三酯(TAG)含量有5～10%的提高。其次,强化TAG合成限速步骤。文献表明,谷氨酸棒杆菌的基因组中没有明确标注的GPAT功能基因。本课题对谷氨酸棒杆菌TAG合成途径中的GPAT功能基因进行鉴定并研究GPAT对微生物油脂合成的影响。基于生物信息学技术预测了C.glutamicum ATCC13032 编码 GPAT 的多个候选功能基因(cg0896、cg2095、cg2777、cg2096和cg3254),并选择其中之一 cg2777基因进行后续分析与验证。作为假定膜蛋白基因cg2777的敲除影响菌株的生长,同时不利于脂肪酸和TAG的合成;过表达基因cg2777对脂肪酸合成的影响不大,由此推测基因cg2777行使GPAT功能,但是活性不高;异源表达浑浊红球菌PD630的GPAT编码基因plsB1,使胞外游离脂肪酸大幅减少,总脂肪酸产量为1.44 g/L,脂肪酸含量为13.2%,与对照株CT14相比分别提高了 18.9%和32%。最后,构建无抗性合成TAG菌株。前期研究中的TAG合成质粒pZ8-TAG4较大、在发酵中不稳定。本课题构建了整合载体pK18mobsacB-TAG4,基于同源重组原理将pZ8-TAG4中的全部基因(编码二酰基甘油酰基转移酶DGAT的基因atf1和atf2、编码磷脂酸磷酸酶PAP的基因pgpB以及甘油三酯积累基因tadA)定向整合到谷氨酸棒杆菌染色体ISCg3a位置,经菌落PCR验证证明构建获得成功,后续还需要进行测序、表型测定等进一步验证,以期实现微生物油脂合成基因在谷氨酸棒杆菌中稳定遗传表达,为构建产油脂能力更高、性能更稳定、无抗性基因的谷氨酸棒杆菌工程菌株奠定基础。