14-3-3γ通过mTOR途径调节奶牛乳腺上皮细胞乳合成乳品质是乳品工业的重要基础,而乳蛋白含量是乳品质的代表性指标。近年来,随着乳品工业的发展和健康消费的需求,人们对乳制品的需求越来越多。但在中国和很多发展中国家,生乳品质低下已成为制约奶牛饲养行业的关键因素。研究人员开始聚焦如何提高乳品质和产量,而通过现代分子生物学方法阐明乳蛋白和乳脂肪合成的调控机理已成为这一领域的主要研究内容。国内外研究已取得了一定的进展,已证实PI3K/AKT/mTOR是调控细胞生长和增殖的主要信号通路,而在奶牛乳腺上皮细胞营养素和激素能够通过mTOR信号通路调节乳的合成。14-3-3蛋白家族成员广泛存在于各类生物组织细胞中,参与很多生物学过程,如细胞生长、细胞周期、增殖、代谢、基因转录、信号转导、蛋白质合成等。14-3-3蛋白通过决定底物的亚细胞定位以促进和抑制有关的信号转导如mTOR信号通路过程。尽管已有很多这方面的报道,但还不清楚14-3-3是否通过mTOR信号通路调节乳合成和细胞增殖。本实验室前期蛋白质组学研究工作发现,14-3-3γ与乳蛋白合成相关,但其作用机制尚不清楚。因此本文通过基因功能研究以阐明14-3-3γ是否通过调节乳合成和细胞增殖。首先采用组织块法培养原代奶牛乳腺上皮细胞,采用激光共聚焦显微镜观察细胞角蛋白18和β-酪蛋白的表达以确定细胞纯化成功并具有泌乳的能力。激光共聚焦显微镜观察表明14-3-3γ定位于细胞浆和细胞核。Western blotting分析表明,蛋氨酸、赖氨酸、雌激素和催乳素均能刺激14-3-3γ表达,HPLC检测发现β-酪蛋白的分泌也显著增加,甘油三酯试剂盒检测发现乳脂肪的分泌也显著增加,CASY细胞活力分析仪检测发现细胞活力和细胞数也显著增加。这些结果提示14-3-3γ在奶牛乳腺上皮细胞泌乳和增殖过程中起着正向调节作用。构建pGCMV-IRES-EGFP-14-3-3γ表达载体,并转入原代奶牛乳腺上皮细胞,继而利用G418筛选构建了稳定转染14-3-3γ的原代奶牛乳腺上皮细胞系,以此为材料研究14-3-3γ对奶牛乳腺上皮细胞泌乳和增殖的影响。发现14-3-3γ过表达后,mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白表达显著上调,细胞活力和细胞数显著增加,细胞分泌酪蛋白和甘油三酯显著增多。另一方面,将14-3-3γ的siRNA利用瞬时转染技术转入原代奶牛乳腺上皮细胞,观察其对泌乳和增殖的影响。发现14-3-3γ基因沉寂后,mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白表达显著下调,细胞活力和细胞数显著下降,细胞分泌酪蛋白和甘油三酯显著减少。以上结果表明14-3-3γ应答氨基酸、激素等外源信号,通过激活mTOR信号通路正向调节奶牛乳腺上皮细胞乳合成和细胞增殖。本文同时对14-3-3γ的蛋白质结构和功能进行了生物信息学分析,讨论其发挥作用的分子机制。