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戊型肝炎(hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)引起的一种经消化道传播的传染病,常因粪便污染水源而引起暴发流行,临床上主要表现为急性肝炎,在孕妇中病死率高达20%,慢性肝病患者合并HEV感染易引发肝功能衰竭。此外,近年发现在器官移植和免疫缺陷患者中戊型肝炎可以慢性化并导致肝纤维化。戊型肝炎在发展中国家多见,但由于HEV的动物源性特点,近年在发达国家发病数也大幅增加,我国在2012年戊型肝炎发病人数已超过甲型肝炎发病人数,成为一个严重的公共卫生问题。因此,加强戊型肝炎疫苗的研发并及时推广应用对预防和控制戊型肝炎意义重大。HEV是一种RNA病毒,无包膜,基因组含有ORF1、ORF2和ORF3三个读码框架。其中ORF2编码的结构蛋白(pORF2)全长660个氨基酸(amino acid、aa),位于病毒表面,构成病毒的衣壳。我们前期的研究发现HEV ORF2基因编码蛋白C端452-617aa的重组蛋白(p166)含有HEV构型依赖性中和抗原表位,也是HEV的主要抗原表位,因此p166可作为包被抗原,应用间接法ELISA检测血清中抗-HEV。在此基础上我们利用大肠杆菌表达了含有HEV中和抗原表位的可溶性pORF2截短蛋白p179 (aa439-617),发现p179能够有效诱导机体产生高滴度的HEV中和抗体,能够保护动物抵抗HEV的攻击,可以用于戊型肝炎重组疫苗的研发。目前该p179疫苗已进入临床试验阶段。本论文是在p166,p179蛋白的研究基础上分别进行了N端和C端的延长,构建出了3个包含有更多抗原表位的新的HEV pORF2截短蛋白并对其免疫原性和抗原性进行研究,旨在为戊型肝炎重组疫苗的进一步研发提供更多的科学依据。研究结果主要分为以下三个部分：一. 截短蛋白pORF2aa439～660、PORF2aa422～637、pORF2aa430～660的原核表达及其特性分析由于蛋白质能否有效表达很难预测,实验早期以p179为基础共设计了20个不同长度的pORF2截短片段进行表达尝试。利用基因重组技术构建了含有HEV ORF2的pET28a重组质粒,并在大肠杆菌中进行表达,其中13个截短蛋白可以得到高效表达,并将这些蛋白分别命名为pORF2aa439～627、pORF2aa439～637、pORF2aa439～647、 pORF2aa439～660、pORF2aa422～617、pORF2aa422～627、pORF2aa422～637、 pORF2aa430～617、pORF2aa430～647、pORF2aa430～660、pORF2aa402～606、 pORF2aa410～606和pORF2aa419～606。在成功表达的13种蛋白中,我们选取了片段较长的3个重组蛋白pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637和pORF2aa430～660进行蛋白质的可溶性分析,发现这3种不同长度的蛋白都可以在细菌裂解上清中存在,呈可溶性表达。SDS-PAGE分析显示pORF2aa439～660、pORF2aa422～637和pORF2aa430～660分子质量分别为24.4kDa、23.8kDa和25.4kDa,在天然状态下呈二聚体。最后根据表达蛋白所携带的His标签,利用镍离子金属螫合亲和层析技术获得了纯化蛋白。二.截短蛋白pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660与p179、p166免疫原性和抗原性的比较研究为了进一步研究3种不同长度的截短蛋白与p166、p179的免疫原性和抗原性的差异,将纯化后的5种HEV重组蛋白以生理盐水稀释至100mg/L,然后分别加入等体积铝佐剂(1g/L),颠倒混匀30mmin,即为制备的实验性戊肝疫苗。用皮内注射的方法分别免疫5组小鼠,每组6只,每只200μl(含抗原10μg),并于首次免疫后的第3周,第5周及第33周各进行1次加强免疫,免疫剂量和途径与首次免疫相同。定期采集小鼠血清,分别用p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660作为包被抗原来检测p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫后血清中的抗-HEV IgG抗体,观察抗体滴度的升高、维持、下降等变化过程直至首次免疫后第35周,将同组小鼠的每一份血清在同一稀释度下所测OD值取平均值进行统计。结果如下：A.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,p166免疫小鼠所得血清用p166包被检测,抗-HEV IgG抗体滴度分别为1：1600、1：6400、1：51200、1：25600、1：3200和1：51200；用p179、pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660包板检测,抗体滴度相同,分别为1：800、l：3200、1：25600、1：12800、1：3200、l：25600；B.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,p179免疫小鼠所得血清用p166检测,抗-HEV IgG抗体滴度分别为1：3200、1：12800、1：51200、1：25600、1：6400、1：51200；用p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、 pORF2aa430～660包板检测,所得抗体滴度相同,均分别为1：1600、1：12800、1：51200、1：12800、1：6400、1：51200；C.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,pORF2aa439～660免疫小鼠所得血清用p166检测,抗-HEV IgG抗体滴度分别为1：12800、1：409600、1：1638400、1：204800、1：204800、1：1638400；用p179包被检测,抗体滴度分别为l：3200、1：102400、1：819200、1：102400、1：204800、1：1638400；用pORF2aa439～660检测,抗体滴度分别为1：6400、1：102400、1：409600、1：204800、1：204800、1：819200；用pORF2aa422～637检测,抗体滴度分别为1：3200、1：102400、1：409600、1：204800、1：204800、1：1638400；用pORF2aa430～660检测,抗体滴度分别为1：3200、1：102400、1：409600、1：204800、1：204800、1：819200；D.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,pORF2aa422～637免疫小鼠所得血清用p166检测,抗-HEV IgG抗体滴度分别为1：6400、1：204800、1：819200、1：204800、1：204800、1：1638400；用p179检测,抗体滴度分别为1：3200、1：102400、1：819200、1：204800、1：204800、1：1638400；用pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660检测,抗体滴度相同均分别为1：6400、1：204800、1：819200、1：204800、1：204800、1：819200；E.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,pORF2aa430-660免疫小鼠所得血清用p166检测,抗-HEV IgG抗体滴度分别为1：6400、1：409600、1：819200、1：204800、1：204800、1：819200；用p179检测,抗体滴度分别为1：3200、1：102400、1：409600、1：204800、1：204800、1：819200；用pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660检测,抗体滴度相同均分别为1：6400、1：204800、1：409600、1：204800、l：204800、1：409600。F.运用生物信息学分析软件,对p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、 pORF2aa430～660的中和抗原表位的突出情况作了分析,结果显示5种蛋白的中和抗原表位突出面积分别为12.93,12.01,9.681,11.24以及9.372,此数据说明五种蛋白天然二聚体状态下p166突出程度最明显,pORF2aa430～660突出程度最弱,可以部分解释p166的抗原性优于其他4种截短蛋白的原因。综合上述研究结果,我们发现在相同的免疫时间点,pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫小鼠的血清滴度明显高于p166、p179的血清滴度,说明长片段蛋白的免疫原性明显好于短片段蛋白。此外,同一份血清,在相同滴度下,用p166包被检测所得OD值的平均值大于其他4种蛋白所检测的OD值的平均值,经t检验差异具有统计学意义,提示p166的抗原性强于其他4种蛋白。三. p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫血清的HEV中和作用本实验采用基于PCR的HEV体外中和试验,来评价p166、p179、pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫小鼠血清的中和活性。结果如下：A. p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637和PORF2aa430～660的小鼠免疫血清均有中和作用,其中和效价分别为1：8、1：8、1：80、1：80和1:4.pORF2aa439～660, pORF2aa422～637免疫血清中和效价最高,pORF2aa430～660免疫血清中和效价最低。结论：1.在p179的基础上进行N端和C端的延长,能够获得包含更多抗原表位的、具有良好可溶性的、并可以二聚体形式出现的HEV pORF2截短蛋白；2.新的截短蛋白pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660和p166、p179进行比较发现,5种蛋白均具有良好的免疫原性和抗原性,pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫原性优于p166和p179,而p166的抗原性优于pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660和p179；3. pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660诱导产生的免疫血清均具有中和活性,但pORF2aa430～660片段的免疫血清中和效价最低,pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637免疫血清中中和抗体的效价较高,该两截短蛋白有可能作为戊型肝炎重组疫苗的候选片段,值得深入研究。