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上世纪90年代H9N2和H5N1亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）在中国出现，随后这两个亚型AIV在我国广泛流行。而H9N2亚型AIV在中国地区广泛流行，不仅对家禽造成危害，而且也能感染哺乳动物和人,对人类的健康产生了一定的威胁。2.3.4.4分支H5N6亚型是我国目前H5亚型AIV中最主要的流行病毒，而且已经引起16人感染（WHO，2016），给人类公共卫生安全以及养禽业构成了极大的威胁。
本研究选取禽源、猪源、人源等不同宿主来源的8株H5N6亚型流感病毒并结合GISAID数据库提供的H5N6序列，系统分析了H5N6亚型AIV全基因序列分子特性以及遗传进化规律。研究结果表明H5N6亚型AIV在自然条件下的重组复杂且没有一个固定的模式，HA基因分析发现2.3.2分支H5N6亚型AIV较少，当前流行的H5N6 AIV毒株中，2.3.4.4分支H5N6亚型AIV为主要流行毒株，本研究中的毒株除一株为2.3.2分支以外，其他的都为2.3.4.4分支；NA基因主要分为两个分支，即 Stalk Deletion分支和No Deletion分支，而NA茎部缺失为主要分支，我们所分离的2.3.4.4 H5N6毒株中除了一株毒株不存在茎部的缺失，其他的毒株均属于 Stalk Deletion。H5N6亚型AIV内部基因的研究发现，其内部片段在流感病毒的进化过程中，出现与低致病性的流感病毒的重组，PA、PB1、PB2片段不仅有来源于H5亚型AIV,也有部分来自于H6以及H9亚型AIV；NP、NS以及M基因主要来源于H5和H9亚型AIV；另外，大部分人感染H5N6 AIV内部片段PB2也来源于H9N2亚型AIV。
近年来，H9N2亚型AIV源源不断地为H5亚型、H10N8亚型和H7N9亚型AIV提供内部基因，已有的研究表明，流感病毒聚合酶在病毒的致病性、重组、跨宿主传播中一直扮演着重要的角色，但PB2蛋白功能及作用机制还有许多未解之迷，值得深入探讨。课题组的前期研究证明，当PB2蛋白的627位为赖氨酸（K）时，H9N2亚型AIV能在小鼠体内高效复制，并造成小鼠的死亡。但当PB2627为谷安酸（E）时，可以感染小鼠，但是没有致病性。基于此，本实验室前期将Strep、Flag标签插入在该毒株PB2基因羧基端，通过反向遗传技术拯救能够稳定表达蛋白标签的重组AIV；感染人源细胞HEK293T后，利用Pull-Down技术获得与PB2蛋白可能存在相互作用的人源细胞蛋白DDX48，从宿主角度出发解释PB2蛋白627位点造成H9N2亚型AIV致病性差异的原因。
通过BiFC以及Co-IP技术，证明PB2蛋白可以与人源细胞中DDX48蛋白相互作用， 互作区域为DDX48结构域Ⅱ。通过Co-IP，同时证明DDX48蛋白还能与NP蛋白以及PB1蛋白相互作用。此外，在HEK293T细胞上分别共转染PB2（K627）和DDX48以及PB2（K627E）和DDX48后，发现DDX48与PB2（K627）和PB2（K627E）都能在细胞中共定位，并且能使PB2移位表达。
在HEK293T细胞上，利用siRNA干扰DDX48的表达后，VK627聚合酶的活性、PB2 RNA的合成以及VK627在HEK293T细胞上的增殖能力都受到了抑制，对VK627E的影响不明显；但过表达后，与对照组相比，VK627和VK627E在HEK293T细胞上增殖能力变化不明显。随后，利用CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除宿主DDX48基因，并感染VK627和VK627E病毒，结果表明，DDX48能促进VK627的增殖。我们用VK627和VK627E感染敲除了DDX48的细胞系，发现与对照组以及VK627E感染组相比流感病毒的NP在该细胞上出现了部分核滞留，部分抑制了NP的出核。
综上所述，通过对H5N6亚型AIV进行全基因序列分析，发现当前主要流行的H5N6毒株属于2.3.4.4分支，并且大部分NA基因存在颈部缺失。内部片段出现与低致病性的流感病毒的重组，部分来源于H9亚型AIV。研究表明人源细胞蛋白DDX48能与H9N2亚型AIV PB2蛋白相互作用，互作区域为DDX48结构域Ⅱ；进一步研究表明DDX48能促进H9N2亚型AIV（VK627）在哺乳动物细胞上的增殖，并且促进了H9N2亚型AIV（VK627）NP的出核和PB2（K627）RNA的合成。宿主DDX48与流感病毒相互作用分子机制，提示DDX48可作为抑制禽流感病毒增殖的药物靶标，具有重要的理论价值和应用前景。
本研究选取禽源、猪源、人源等不同宿主来源的8株H5N6亚型流感病毒并结合GISAID数据库提供的H5N6序列，系统分析了H5N6亚型AIV全基因序列分子特性以及遗传进化规律。研究结果表明H5N6亚型AIV在自然条件下的重组复杂且没有一个固定的模式，HA基因分析发现2.3.2分支H5N6亚型AIV较少，当前流行的H5N6 AIV毒株中，2.3.4.4分支H5N6亚型AIV为主要流行毒株，本研究中的毒株除一株为2.3.2分支以外，其他的都为2.3.4.4分支；NA基因主要分为两个分支，即 Stalk Deletion分支和No Deletion分支，而NA茎部缺失为主要分支，我们所分离的2.3.4.4 H5N6毒株中除了一株毒株不存在茎部的缺失，其他的毒株均属于 Stalk Deletion。H5N6亚型AIV内部基因的研究发现，其内部片段在流感病毒的进化过程中，出现与低致病性的流感病毒的重组，PA、PB1、PB2片段不仅有来源于H5亚型AIV,也有部分来自于H6以及H9亚型AIV；NP、NS以及M基因主要来源于H5和H9亚型AIV；另外，大部分人感染H5N6 AIV内部片段PB2也来源于H9N2亚型AIV。
近年来，H9N2亚型AIV源源不断地为H5亚型、H10N8亚型和H7N9亚型AIV提供内部基因，已有的研究表明，流感病毒聚合酶在病毒的致病性、重组、跨宿主传播中一直扮演着重要的角色，但PB2蛋白功能及作用机制还有许多未解之迷，值得深入探讨。课题组的前期研究证明，当PB2蛋白的627位为赖氨酸（K）时，H9N2亚型AIV能在小鼠体内高效复制，并造成小鼠的死亡。但当PB2627为谷安酸（E）时，可以感染小鼠，但是没有致病性。基于此，本实验室前期将Strep、Flag标签插入在该毒株PB2基因羧基端，通过反向遗传技术拯救能够稳定表达蛋白标签的重组AIV；感染人源细胞HEK293T后，利用Pull-Down技术获得与PB2蛋白可能存在相互作用的人源细胞蛋白DDX48，从宿主角度出发解释PB2蛋白627位点造成H9N2亚型AIV致病性差异的原因。
通过BiFC以及Co-IP技术，证明PB2蛋白可以与人源细胞中DDX48蛋白相互作用， 互作区域为DDX48结构域Ⅱ。通过Co-IP，同时证明DDX48蛋白还能与NP蛋白以及PB1蛋白相互作用。此外，在HEK293T细胞上分别共转染PB2（K627）和DDX48以及PB2（K627E）和DDX48后，发现DDX48与PB2（K627）和PB2（K627E）都能在细胞中共定位，并且能使PB2移位表达。
在HEK293T细胞上，利用siRNA干扰DDX48的表达后，VK627聚合酶的活性、PB2 RNA的合成以及VK627在HEK293T细胞上的增殖能力都受到了抑制，对VK627E的影响不明显；但过表达后，与对照组相比，VK627和VK627E在HEK293T细胞上增殖能力变化不明显。随后，利用CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除宿主DDX48基因，并感染VK627和VK627E病毒，结果表明，DDX48能促进VK627的增殖。我们用VK627和VK627E感染敲除了DDX48的细胞系，发现与对照组以及VK627E感染组相比流感病毒的NP在该细胞上出现了部分核滞留，部分抑制了NP的出核。
综上所述，通过对H5N6亚型AIV进行全基因序列分析，发现当前主要流行的H5N6毒株属于2.3.4.4分支，并且大部分NA基因存在颈部缺失。内部片段出现与低致病性的流感病毒的重组，部分来源于H9亚型AIV。研究表明人源细胞蛋白DDX48能与H9N2亚型AIV PB2蛋白相互作用，互作区域为DDX48结构域Ⅱ；进一步研究表明DDX48能促进H9N2亚型AIV（VK627）在哺乳动物细胞上的增殖，并且促进了H9N2亚型AIV（VK627）NP的出核和PB2（K627）RNA的合成。宿主DDX48与流感病毒相互作用分子机制，提示DDX48可作为抑制禽流感病毒增殖的药物靶标，具有重要的理论价值和应用前景。