DExH/D-box蛋白是RNA解螺旋中最大的家族，属于超家族2(SF2)解螺旋酶，DExH/D-box蛋白参与RNA从转录、翻译到降解的几乎所有代谢过程。DEAD-box蛋白家族是DExH/D-box蛋白家族的典型代表。DEAD-box蛋白是由两个高度保守RecA样的结构域组成，包含13个特征性的基序，DEAD-box蛋白命名就是由基序Ⅱ中的Asp-Glu-Ala-Asp(DEAD)序列而来。DEAD-box蛋白以ATP依赖的方式催化RNA双链解旋，与传统的依靠在核酸链上移位来解开双链的解螺旋酶不同，DEAD-box蛋白是通过局部双链解开的方式进行解旋，只能解开较短的RNA-RNA或DNA-RNA双链，而且该过程不需要消耗ATP，该过程中ATP的存在只是为了促进DEAD-box蛋白与RNA结合，ATP水解促进酶的再循环。对于多数DEAD-box蛋白来说，邻近的单链RNA会促进蛋白结合到双链区域，而且对单链的方向没有依赖性。这种解螺旋机制被称为局部双链解开模型，而且这种模型被认为是唯一适合DEAD-box蛋白在细胞内催化RNA和RNA-蛋白质复合物重组的方式。Ded1p来自于酿酒酵母，是DEAD-boxRNA解螺旋酶家族的典型代表，它被作为染色体内编码HIS3基因的一个重要结构域而获得首次分离，所以被命名为Ded1: Defines Essential Domain1。研究表明，Ded1p以低聚体的形式发挥解螺旋活性。　　单分子荧光共振能量转移技术(single molecule fluorescence resonant energytransfer，sm-FRET)通过检测单个分子内的荧光供体与荧光受体间荧光能量转移效率，来研究分子构象的变化。相对于传统的探测分子的综合平均效应的技术来说，sm-FRET可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可以研究生物分子的动力学反应。Sm-FRET近年来在探究生物学机理方面迅猛发展，包括DNA的复制和重组、RNA转录、蛋白的翻译、RNA的折叠和催化，蛋白折叠和构象变化，马达蛋白、膜融合蛋白、离子通道、信号转导以及解螺旋酶等。　　本文以全长的Ded1p为研究对象，首先利用0.5 mM IPTG诱导BL21(DE3)菌株表达出可溶性的Ded1p，并结合Ni-NTA agarose亲和层析纯化和Capto-DEAE弱阴离子交换层析两步纯化，得到纯净的Ded1p，然后跑PAGE胶验证Ded1p是否具有解螺旋酶活性。其次，制备不同双链长度和不同ssRNA方向性的荧光标记的4种dsRNA底物，利用sm-FRET验证底物的制备效果是否符合实验要求。最后，利用sm-FRET实验探究Ded1p对双链RNA的解螺旋机制。　　实验结果表明，首先，Ded1p能够在单分子层面解开双链RNA，且解链速率具有ATP浓度依赖性，双链RNA长度越长解旋速率越慢，对单链尾巴的方向没有依赖性，但是带有3端单链尾巴的双链RNA的解螺旋速率要稍微大于带有5端单链尾巴的双链RNA;其次，对于13bp dsRNA或16 bp dsRNA底物，Ded1p均以一步解开双链RNA为主，但有30％的双链RNA分子是两步解链;最后，对于不同长度的双链RNA解开前，均会出现一个或多个非完全水解的解螺旋小峰，且差异不大，我们定义为前干扰过程，且该过程没有链长度和方向的依赖性。通过分析小峰的动力学过程，发现对于每个小峰内包含2-3个隐藏步骤，与ATP的结合和水解过程一致。通过分析小峰和两步解链中间态的FRET分布，发现其FRET效率与解开6-10个碱基相一致。这些结果与局部双链解开模型一致，所以我们从单分子层面直接揭示Ded1p的解螺旋机制为前干扰的局部双链解开模型。