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鳞翅目害虫二化螟Chilo suppressalis(Walker)是危害我国水稻生产最严重的害虫之一。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的杀虫蛋白(Cry)已经成功地转入到水稻中用于防治二化螟等害虫。研究昆虫对Cry蛋白的防御机制有利于更好地应用转基因抗虫作物。昆虫对Cry蛋白的细胞防御反应主要受丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)路径调控,而MAPK只是应急信号通路之一,并不直接参与对抗成孔杀虫蛋白,其下游基因才起真正的防御作用。实验室前期研究发现,p38 MAPK参与了二化螟对Cry1Ca的防御过程,但对Cry1Ca起防御作用的p38 MAPK下游基因并不清楚。MAPK下游基因的激活可能受p38MAPK通路磷酸化进行调控的。因此,本研究首先利用差异磷酸化蛋白质组筛选受Cry1Ca诱导的差异磷酸化蛋白、再通过RNA干扰技术鉴定候选蛋白与Cry蛋白毒力之间的关系、最后利用q PCR等技术分析目的基因的表达模式及其与p38 MAPK的上下游关系。研究结果对明确昆虫对Cry蛋白的防御机制具有重要意义,同时为提高Cry蛋白对靶标昆虫的毒力、延缓靶标昆虫对转Bt抗虫作物的抗性发展提供新的思路和理论依据。主要结果如下:1.利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ)技术测定Cry1Ca处理和无Cry1Ca处理组的二化螟中肠磷酸化蛋白质组,一共得到了523个唯一肽段,其中发生磷酸化的蛋白有437个。Cry1Ca处理与无Cry1Ca处理的二化螟中肠中磷酸化水平差异的蛋白有45个,其中,磷酸化程度上调的有21个,下调的有24个。按照磷酸化差异倍数和文献检索,我们选择了其中7个基因进行下一步实验。根据二化螟转录组注释,这7个基因为uncharacterized protein LOC101736359(Up101)、uncharacterized protein LOC105391923 isoform X2(Up105)、domain-binding glutamic acid-rich protein homolog(Gph)、autophagy-related protein 2 homolog A-like(Arp)、protein lethal(2)essential for life-like(Elf2)、spectrin alpha chain isoform X3(Sac)、thioredoxin-related transmembrane protein 1-like(Trtp)。2.合成靶标基因的ds RNA,用饲喂法进行RNA干扰。利用q PCR技术检测喂食ds RNA 48小时后靶标基因的m RNA的表达量变化。结果显示Up101、Up105、Gph、Arp、Elf2、Sac、Trtp基因的表达量明显下调。将抑制基因表达后的二化螟幼虫转到T1C-19(表达Cry1Ca蛋白)、TT51(表达Cry1Ab/Cry1Ac蛋白)、T2A-1(表达Cry2Aa蛋白)3种转基因水稻上,结果显示,只有Elf2基因被抑制表达后,二化螟幼虫取食这三种水稻的死亡率比对照组显著升高,表明只有Elf2基因参与了二化螟对3种Cry蛋白的防御作用。3.获得Elf2全长序列后,利用NCBI blast进行搜索显示该基因含有一个典型的small heat shock protein(s Hsp)功能域。其开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)共507bp,编码168个氨基酸,预测蛋白分子质量为19.01 k Da。系统发育分析表明,Elf2的蛋白序列与斜纹夜蛾的Hsp19.3同源性最高。Elf2时空表达模式分析表明该基因在4龄幼虫的体内表达量最高,且在中肠中表达量最高。进一步利用q PCR技术验证该基因与p38的转录调控关系,结果显示,饲喂ds Csp38后,Elf2的表达量显著下降,饲喂的ds Elf2后,p38的表达量没有显著变化。表明Elf2基因位于p38MAPK通路的下游。