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骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨恶性肿瘤，在20岁以下人群中是致死率第3高的恶性肿瘤，仅排在白血病和神经系统肿瘤之后。骨肉瘤好发于生长迅速的长骨生长板，如股骨远端、胫骨近端和肱骨远端，膝关节周围部位骨肉瘤的发生率占60%。骨肉瘤恶性程度高，20%的患者在初次就诊时已发现影像学可见的远隔器官（特别是肺）转移灶。过去30年间，通过联合应用外科手术治疗、辅助化疗和新辅助化疗等治疗方案，骨肉瘤患者的5年生存率从不足20%提高到了70%。然而由于高的转移复发和耐药性，转移性骨肉瘤患者的5年生存率低于30%。肺转移导致的呼吸衰竭是骨肉瘤患者致死的主要原因。然而迄今为止，我们对骨肉瘤转移复发的分子机制还没有完全认识清楚，但是通过对骨肉瘤形成、增殖、转移、耐药等方面广泛深入的研究，人们发现Rb、P53基因等抑癌基因在部分骨肉瘤患者中表达失活，而c-MYC、c-FOS等促癌基因却在一些肿瘤患者有异常活化。Notch是进化中高度保守的细胞与细胞间信号转导通路，广泛存在于从线虫到人的生物体中。Notch信号通路通过调控细胞的增殖、凋亡和分化，在胚胎发育、稳态维持、机体的免疫调控及肿瘤等疾病的产生过程中发挥重要作用。近年来研究证实Notch在T淋巴细胞白血病、肺癌、结肠癌、前列腺癌及乳腺癌等肿瘤中异常活化。Jagged1是Notch的重要配体，在乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中，Jagged1的表达与肿瘤的转移和预后密切相关；实验证实Jagged1介导的Notch信号通路能促进多种肿瘤细胞的侵袭、迁移。最近研究发现Notch信号通路分子的异常表达将影响成骨细胞增殖、分化。以往有学者认为骨肉瘤正是由于间充质细胞或骨祖细胞分化受阻形成的。因此我们猜测在骨肉瘤中，Notch信号通路可能发挥着促癌基因的作用。事实上，有研究已在骨肉瘤中发现Notch分子的异常表达和Notch信号通路的活化，但是Notch配体Jagged1在骨肉瘤中的作用还没有详细报道。为了进一步研究Jagged1在骨肉瘤中的作用，在本实验中，我们进行了以下工作：实验目的：1.通过肿瘤标本组织免疫组化染色，明确Jagged1基因在骨肉瘤患者中的表达和意义；2.利用干扰RNA技术，研究Jagged1对骨肉瘤细胞体外增殖、细胞周期及侵袭、迁移的作用。实验方法：1.利用本科室丰富的骨肉瘤石蜡标本库资源，选取自2007-2009年手术切除的骨肉瘤石蜡标本68例。石蜡包块切片后进行Jagged1分子的免疫组化染色，染色强度由两位实验师分别进行评定，最后汇总临床资料进行实验数据整理分析。2.利用半定量PCR、Real-time PCR和Western-blot方法分析了本科室培育的低转移骨肉瘤细胞株F4和高转移骨肉瘤细胞株F5M2细胞中Jagged1基因和Notch受体的表达。3.化学合成Jagged1基因siRNA和无关序列的对照siRNA，通过脂质体转染F5M2骨肉瘤细胞后，利用半定量PCR、Real-time PCR和Western-blot方法检测了siRNA对F5M2细胞中Jagged1基因的沉默效果。同时构建了jagged1基因的shRNA载体，尝试建立Jagged1基因沉默的F5M2细胞亚系。4.通过MTT、平板克隆形成、细胞周期实验验证了siRNA沉默Jagged1基因后对肿瘤细胞增殖、细胞周期的作用。5.通过Transwell实验验证siRNA沉默Jagged1基因后对肿瘤细胞迁移、侵袭能力的影响。实验结果分析：1.通过对68例骨肉瘤标本的免疫组化染色分析，我们发现Jagged1分子在47例标本中呈强阳性表达，阳性表达率为69%；更为值得注意的是在24例转移复发性骨肉瘤标本中，Jagged1的阳性表达率高达87.5%，其中包括17例强阳性（+++），4例中等阳性（++），而非转移组Jagged1的阳性表达率为59%，包括6例强阳性和20例中等阳性；两组之间具有显著的统计学差异（P=0.0154），表明Jagged1与骨肉瘤的转移复发密切相关。2.利用半定量PCR和Western-blot实验，我们发现Jagged1分子在F5M2细胞中的表达高于F4细胞，Real-time PCR定量结果进一步显示F5M2细胞中Jagged1的表达量是F4细胞中的2.8倍；而4种Notch受体中，仅Notch1在F5M2中的表达升高，其他3种受体表达没有明显差异。3.通过转染Jagged1特异性的siRNA，Jagged1基因在F5M2细胞中的表达被成功抑制，与对照组相比，最好的抑制效率达到80%，符合进一步实验要求；但转染带有绿色荧光筛选标签的Jagged1shRNA质粒后，由于转染效率等原因，我们未能建立Jagged1基因沉默的F5M2骨肉瘤细胞亚系。4.通过MTT实验我们证实沉默Jagged1基因能明显抑制骨肉瘤的体外增殖；在平板克隆实验中，实验组中的克隆形成数明显少于对照组（67±6vs33±5），二者具有统计学差异；细胞周期实验表明沉默Jagged1基因阻滞了肿瘤细胞从G1期向S期的过度。5.通过Transwell实验证实通过沉默Jagged1基因能有削弱肿瘤细胞迁移、侵袭能力。结论：我们的实验结果提示Jagged1在69%的骨肉瘤患者中高表达，Jagged1的表达水平与骨肉瘤的转移复发正相关；在细胞实验中通过阻断Jagged1的表达能有效抑制骨肉瘤细胞体外增殖和转移。