大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）是产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）产生的一种能导致人或幼畜肠炎和腹泻的毒性因子。是目前最强有力的粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂之一，具有较强的免疫调节作用，可以刺激机体产生多种细胞因子。但由于其本身具有很强的肠毒性不宜直接使用，因此人们构建了许多无毒或减毒突变体，其中双突变体LTRG毒性比野生型LT低很多。本实验利用大肠杆菌表达的重组LT蛋白免疫小鼠或刺激小鼠巨噬细胞，采用建立的荧光定量PCR方法分析了LT黏膜佐剂对小鼠体内、及刺激细胞内的6种细胞因子IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6动态变化。同时采用液相芯片技术及流式细胞技术，分析了LT蛋白作用下巨噬细胞内这6种细胞因子的表达及T淋巴细胞的变化。不同剂量的LTRG蛋白作用体外培养的小鼠巨噬细胞，结果1ug/ml的LTRG蛋白对巨噬细胞的刺激效果最明显，对IL-1β和IL-4细胞因子变化最显著。检测LT蛋白处理的小鼠巨噬细胞中细胞因子的mRNA表达量变化，结果显示野生型LT组IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表达量分别在免疫后2h、4h和12h达到峰值，与对照组差异极显著（p＜0.01）；IL-12、IFN-γ、IL-4的mRNA表达量在免疫后24h达到最大值，与对照组差异极显著（p＜0.01）。PBS对照组细胞因子无显著变化。突变型LTRG组细胞因子mRNA的表达量在免疫后达到峰值的时间与野生型LT组相比有不同程度的延迟。为了进一步了解LTRG蛋白对共免疫原的作用，采用LTRG与BSA共免疫小鼠巨噬细胞，结果显示LTRG和BSA协同处理后大多数细胞因子的mRNA表达量在12h达到高峰，与单独使用BSA组差异极显著（p＜0.01）；TNF-α和IL-6的mRNA表达量分别在免疫后8h和24h达到峰值，与BSA组差异极显著（p＜0.01）。BSA对照组细胞因子无显著变化。通过液相芯片技术分析LT对巨噬细胞中细胞因子的影响，由于细胞上清液中蛋白含量比较低，只检测到TNF-α和IL-6的浓度，结果显示LTRG蛋白处理后TNF-α和IL-6的浓度分别在36h和48h达到最大值，与PBS对照组差异极显著（p＜0.01）；LTRG与BSA共免疫后TNF-α和IL-6的浓度在24h达到最大值，与BSA对照组差异极显著（p＜0.01）。以上结果表明LT可以激活小鼠巨噬细胞炎性反应，执行抗原递呈功能，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答，并且可以协同抗原提高免疫效果。LT免疫小鼠实验中检测发现，野生型LT和突变型LTRG蛋白组的各细胞因子分别在免疫后48h和60h左右，小鼠脾脏中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6细胞因子mRNA的表达量达到最大值，与对照组差异极显著（p＜0.01）。PBS对照组细胞因子无显著变化。表明LT及LTRG蛋白都能通过诱导细胞免疫，刺激高水平细胞因子的转录，采用流式细胞术检测LT、LTRG蛋白免疫后小鼠脾脏组织中CD4+及CD8+T淋巴细胞的变化。结果显示，LT和LTRG蛋白免疫小鼠后脾脏中CD4+和CD8+T淋巴细胞比例相比对照组显著提高。表明，LT、LTRG刺激作用显著提高了小鼠的T淋巴细胞免疫应答能力。综上，本研究从转录和翻译水平对LT免疫后细胞、小鼠体内多个细胞因子的变化规律进行了研究，证明LTRG蛋白能够诱导Th1、Th2型细胞免疫反应，产生体液免疫和细胞免疫，产生针对LTRG蛋白抗原的非特异性免疫应答。并能提高共免疫原的免疫效果，促使机体特异性T细胞明显增多。且LTRG蛋白对Th1、Th2细胞免疫反应的促进作用优于野生型LT蛋白，但免疫应答时间迟于LT。