表面活性剂是一种重要的化工原料,由于其具有能够促进物质液化、乳化及化学分子的扩散等性质,被广泛应用于化妆品、洗涤剂、食品、纺织品和药品等工业生产领域；另外,由于其抗粘、消泡、防腐、抗静电等物理化学性质,还被应用在精细化工领域。但是由于化学表面活性剂生物降解性差、某些组分对环境有伤害等原因,相对低毒、对环境友好及生物降解性良好的生物表面活性剂逐渐引起人们的注意。在众多不同种类生物表面活性剂中,槐糖脂是目前已知产量最高、被认为最具发展潜力、将来有可能替代化学表面活性剂的生物表面活性剂。球拟假丝酵母是一类高产槐糖脂酵母菌,目前关于槐糖脂合成过程的研究已有不少报道,但是有关槐糖脂代谢及合成调控相关的研究还未见报道。另外,槐糖脂合成与脂肪酸(尤其是长链脂肪酸)代谢的关系密切,但是有关产槐糖脂菌株是如何摄取外界环境中长链脂肪酸的这一过程的研究鲜有报道。对于槐糖脂合成、代谢过程中关键酶及调控基因的研究将有助于在基因水平对槐糖脂生产菌株进行遗传改造,从而能够获得高产特定组分槐糖脂的工程菌株。基于此,本论文以槐糖脂产生菌球拟假丝酵母为研究对象,展开下列相关研究。主要研究内容及结果如下：1.槐糖脂代谢相关单加氧酶基因moA功能的研究本论文研究所用球拟假丝酵母Starmerella bombicola,是一类产槐糖脂酵母菌,由本实验室早期在含油污水中筛选得到,起初通过生理生化实验鉴定为拟威克酵母Wickerhamiella domercqiaevar. Sophorolipid。近期通过基因组序列分析,将该菌株重新归类为球拟假丝酵母S. bombicola。球拟假丝酵母S. bombicola CGMCC 1576能够发酵产生大量的槐糖脂,根据其结构不同,所产槐糖脂主要分为内酯型和酸型两种类型。本研究发现在槐糖脂产生菌S. bombicola基因组中含有一个潜在的单加氧酶MoA,通过基因组注释分析、蛋白模建及基因敲除等策略,发现其与特异槐糖脂组分-脂肪酸侧链部分为C18:2的双乙酰化酸型槐糖脂(C18:2 DASL)的代谢有关。在敲除株△moA中,槐糖脂组分发生了明显变化,HPLC色谱分析显示,C18：2DASL组分含量由9.84×106 mAU×s提高到34.26×106 mAU×s,提高了248.17%。进一步分析发现,在MoA过表达菌株Peno::moA的发酵液中(以亚油酸和葡萄糖为底物)基本不含有槐糖脂组分C18：2 DASL。将单加氧酶蛋白MoA在大肠杆菌Escherichia coli JM109 (DE3)中进行异源表达,所用重组质粒为pMAL-c2x-moA,得到的重组蛋白MoA能够特异性降解C18：2 DASL槐糖脂组分,而不能降解C18:1DASL组分。2.长链脂肪酸转运蛋白基因alcs功能的研究一般认为脂肪酸转运主要分为两种形式,即蛋白载体介导的运输和磷脂双分子层的扩散作用。目前,人们已发现三类与脂肪酸运输有关的膜蛋白,如：鼠脂肪细胞膜蛋白,脂肪酸转位酶(FAT)；线粒体天冬氨酸转氨酶类脂肪酸结合膜蛋白(FABPpm);3T3-L1脂肪细胞中的脂肪酸转运蛋白(FATP)。而槐糖脂产生菌株球拟假丝酵母S. bombicola具有利用胞外长链脂肪酸合成槐糖脂的能力,但是脂肪酸是如何转运到胞内的这一具体过程还不是很清楚。本研究发现,在该槐糖脂产生菌中含有一个可能与长链脂肪酸转运相关的膜结合蛋白,该蛋白基因编码合成一个长链酯酰-CoA合成酶(ALCS)。将该蛋白基因alcs敲除以后,敲除株在以长链脂肪酸(比如C12：0,C14：0,C16：0,C18：0,C22：0或C24：0)为唯一碳源的基本培养基上几乎不能生长,并且其转运含有荧光基团的长链脂肪酸类似物BODIPY-3823的能力明显下降。基因alcs的缺失还能够引起槐糖脂产物的结构变化,在alcs敲除株的发酵产物中基本没有内酯型槐糖脂生成,并且产生的酸型槐糖脂主要是由脂肪酸侧链部分为中等碳链长度的槐糖脂分子组成。为进一步鉴定ALCS蛋白是否具有长链酯酰-CoA的催化功能,将该蛋白在大肠杆菌JM109(DE3)中进行异源表达,得到的重组蛋白具有能够催化长链脂肪酸和CoA底物形成特异长链酯酰-CoA的能力。3.槐糖脂合成相关调控蛋白基因功能的研究通过不同发酵条件下转录数据分析,发现在以硫酸铵为氮源发酵培养时酸型胞外蛋白酶AxpA转录明显上调,通过比对分析,在球拟假丝酵母基因组中找到其他三个同源蛋白AxpB、AxpC及AxpD,以潮霉素为筛选标记对这四个蛋白进行了共敲除,敲除株在以硫酸铵为氮源发酵条件下的酸型槐糖脂产量得到明显提同。另外,通过生物信息学分析及遗传操作,发现一个与槐糖脂合成、酸碱平衡调控及Ca离子耐受调控相关的蛋白PalA,对其功能进行了初步探究,该蛋白编码基因被敲除以后,缺失突变菌株对碱性环境、高钙离子环境的耐受性下降,并且与槐糖脂合成相关的关键酶基因转录发生沉默。以绿色荧光蛋白EGFP为标记,对该蛋白的细胞定位进行了初步研究,发现该蛋白分布于细胞质溶质中。推测PalA蛋白可能是与槐糖脂合成调控相关的信号通路蛋白。4.通过RecET重组构建槐糖脂高产菌株关于槐糖脂产生菌株的研究,目前已发现多个与槐糖脂合成相关的基因,如长链脂肪酸末端或次末端羟基化酶(CYP52M1)、槐糖脂合成第一步UDP-葡萄糖基转移酶(UGTA1)、合成第二步UDP-葡萄糖基转移酶(UGTB1)、槐糖脂分子中槐糖羟基部位的乙酰基转移酶(SLAT)、槐糖脂转运蛋白(MDR)以及酸型槐糖脂内酯化酶(LIP1)等。在酵母菌S. bombicola中,与槐糖脂合成相关的这几个酶的编码基因,除lip1以外,全部分布在同一个基因簇上。随着工业及医药领域对槐糖脂的需求日益增大,构建某些特定槐糖脂组分产量较高的工程菌株,变得越来越重要。在本论文中,基于以上理论基础,我们通过RecET重组系统,构建了含有双拷贝槐糖脂合成基因簇的过表达菌株OE-5。经蒽酮-硫酸法测定,过表达菌株总槐糖脂产量由56.9g/L提高到79.6g/L,提高了41.7%；内酯型槐糖脂产量由23.1 g/L提高到36.4 g/L,提高了57.6%。高效液相色谱分析结果显示,当以油酸和葡萄糖为复合碳源进行发酵时,过表达菌株OE-5的各槐糖脂组分与野生型菌株类似,但是含量均高于野生型菌株；其中某些特定组分含量有显著提高,如C18:2NASL含量提高了806.59%, C 18:2 DLSL含量提高了35.20%,C18:1 DLSL含量提高了62.52%。5.潮霉素抗性标记自删除系统构建槐糖脂产生菌球拟假丝酵母S. bombicola对多种抗生素具有耐受性,如硫铵吡啶、博来霉素及G418等。在众多抗生素中,潮霉素是迄今为止发现能够有效抑制球拟假丝酵母生长的抗生素。在现有文献报道中,除了ura3营养缺陷型,只有潮霉素抗性hph标记被用来进行球拟假丝酵母S. bombicola的遗传改造。较少的遗传操作筛选标记限制了槐糖脂产生菌的多基因遗传改造。本论文采用p-丝氨酸重组酶及诱导型启动子(半乳糖激酶galk启动子),成功构建了潮霉素抗性自删除筛选系统。通过同源重组,被敲除基因编码区被该筛选标记取代后,所得到的转化子在半乳糖诱导条件下,敲除株的抗性标记发生自我剪切并丢失。最终获得不含有任何抗性筛选标记的敲除株。潮霉素抗性标记自删除系统的构建实现了潮霉素抗性的循环利用,极大地方便了槐糖脂产生菌的多基因遗传改造操作过程。