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低温是影响昆虫地理分布和季节性活动方式的主要环境约束因子。荒漠昆虫小胸鳖甲（Micordera punctipennis）属于避冻型昆虫,可将机体的过冷却点降到过冬所处微环境的温度以下,从而防止体内结冰,允许昆虫在冬季持续进行低速有氧代谢。然而,这种低速有氧代谢可能在昆虫体内诱发活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生,并由此引起ROS对生物大分子的持续损害。因此,昆虫的耐寒抗冻机制中可能包含抗氧化防御。超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内主要的抗氧化酶家族之一,可清除机体内的超氧阴离子自由基（O2·-）,这是生物体内最初产生的ROS分子,可引发更多ROS的形成。因此,SOD被认为是抵抗氧化胁迫的第一道防线。在植物中,关于低温胁迫与SOD基因的表达调控方面已开展了很多研究。但是在昆虫,尤其是耐寒性昆虫中相关研究很少见。本文首次从荒漠耐寒性昆虫小胸鳖甲中克隆获得了胞外和胞质2个Cu/Zn-SOD基因,并对昆虫在低温下Cu/Zn-SOD基因的表达模式、体内总SOD酶活性与超氧阴离子含量的相关性进行了系统研究。研究发现胞外Cu/Zn-SOD基因的表达可迅速响应4℃低温胁迫,低温下总SOD酶活性与O2·-含量存在负相关关系,SOD在避冻昆虫耐寒响应的生理机制中发挥一定的保护作用。利用原核表达系统和转基因果蝇品系研究了小胸鳖甲Cu/Zn-SOD基因在增强细胞和昆虫耐寒性方面的重要作用。通过测定脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤指标,明确了SOD基因在耐寒性昆虫中通过清除冷胁迫下其体内形成的ROS,可有效抵御ROS对生物大分子的氧化损伤。研究结果有助于深入理解荒漠昆虫SOD基因增强细胞耐寒性的功能,为耐寒性昆虫抗寒机制的研究提供了新角度,可丰富昆虫低温生物学的研究内容。本研究的主要内容概述如下。1.小胸鳖甲两种Cu/Zn-SOD基因的克隆及其表达对低温的响应克隆获得了荒漠昆虫小胸鳖甲两种Cu/Zn-SOD基因的全长c DNA序列,其中,MpecCu/Zn-SOD全长800 bp,开放读码框为669 bp,编码222个氨基酸,其N端包含一个17-氨基酸的信号肽;Mpic Cu/Zn-SOD全长769 bp,包含462 bp的开放读码框,其ORF编码153个氨基酸,但N端没有信号肽。MpecCu/Zn-SOD的编码蛋白与其他已知昆虫的同源蛋白的相似性为60%80%;Mpic Cu/Zn-SOD编码蛋白的相似性为79%93%。生物信息学分析表明两种基因的编码蛋白都包含酶活性所需的保守结构域和金属离子结合位点。实时定量PCR结果表明,4℃低温0.5 h就能够显著诱导MpecCu/Zn-SOD基因的表达,而Mpic Cu/Zn-SOD基因mRNA水平在研究的11 h内不受4℃低温诱导。小胸鳖甲体内超氧阴离子自由基（O2·-）含量的测定结果显示,在4℃胁迫0.5 h,其体内O2·-含量就急剧增加,并在随后的胁迫期间出现波动,与MpecCu/Zn-SOD mRNA的变化趋势相一致。小胸鳖甲体内的O2·-含量与总SOD活性呈负相关,相关系数为-0.437。综上所述,本研究的结果表明MpecCu/Zn-SOD可能在寒冷条件下发挥清除ROS的作用。2.小胸鳖甲两个Cu/Zn-SOD基因增强E.coli细胞耐寒性的功能鉴定为了研究每个MpCu/Zn-SOD的功能,分别将两种MpCu/Zn-SOD基因克隆到原核表达载体p ET-32a中,获得重组质粒p ET32a-MpecCu/Zn-SOD和p ET32a-Mpic Cu/Zn-SOD。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,过表达小胸鳖甲胞外、胞内Cu/Zn-SOD的融合蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD和Trx-His-Mpic Cu/Zn-SOD,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定。本研究中将转入p ET32a-MpecCu/Zn-SOD和p ET32a-Mpic Cu/Zn-SOD重组质粒的转化菌BL21分别简称为胞外转化菌和胞内转化菌,转入p ET32a空载质粒的转化菌BL21简称为对照菌。融合蛋白的可溶性分析结果显示,Trx-His-MpecCu/Zn-SOD主要以包涵体形式存在,在25～45℃温度范围内具有稳定的酶活性,并且在35℃时活性最高,表现出广泛的酸碱耐受性（p H 3～12）,最适p H为9.0。融合蛋白Trx-His-Mpic Cu/Zn-SOD在上清和沉淀中均有表达,在上清中所占比例高于沉淀。其酶活性在p H 3～11范围内比较稳定,酶活性在p H为8.0时最高,同时也表现出广泛的温度耐受性（25～55℃）,最适温度为35℃。上述结果表明纯化的两种MpCu/Zn-SOD的酶活性相对比较稳定。抗氧化活性检测表明,两种转化菌BL21在H2O2培养板上的抑菌圈直径均小于对照菌的直径,表明两种转化菌都具有较高的抗氧化能力。在-4℃冷处理下的存活曲线和酶活性检测结果表明,与对照菌相比,两种转化菌表现出更高的耐寒性和SOD活性。相应地,在-4℃冷处理下,胞内转化菌和胞外转化菌的电导率和丙二醛（MDA）含量均低于对照菌。综上所述,过表达两个MpCu/Zn-SOD的大肠杆菌细胞通过清除ROS增强了其对冷胁迫的抵抗力,并减轻了在寒冷条件下由ROS引起的潜在细胞膜脂质损伤。3.两个MpCu/Zn-SOD基因转化果蝇的耐寒性分析基于P因子介导的转基因技术将小胸鳖甲MpecCu/Zn-SOD和Mpic Cu/Zn-SOD基因分别转入果蝇基因组中。通过平衡杂交、筛选和染色体定位,成功获得了5个能稳定遗传的转MpCu/Zn-SOD果蝇品系。将Actin-Gal 4品系与构建好的转基因果蝇品系杂交,启动了两个靶基因在果蝇后代中的高表达。在低温和氧化胁迫下,两种转基因果蝇的存活率均显著于对照品系。与对照组果蝇品系相比,冷胁迫提高了转基因品系的SOD酶活性并显着降低了两种转基因果蝇体内O2·-的积累。此外,在低温条件下,两种转基因果蝇在一定程度上表现出比对照果蝇更少的氧化损伤。研究表明,果蝇中MpecCu/Zn-SOD和Mpic Cu/Zn-SOD基因的过表达,通过消除冷胁迫下其体内形成的O2·-,从而抵御ROS对脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤,由此增强其抗寒性。