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夏枯草,为双子叶唇形科（Labiatae）植物夏枯草（Prunella vulgarisL.）的干燥果穗,台湾多全草使用。性味辛、苦,寒。归肝、胆经。为清肝泻火,明目,散结消肿的常用传统中药,也是卫生部列入药食两用资源之一。《神农本草经》记载:“苦辛寒,治热瘰疬,鼠瘘,头创,破症,散瘿,结气,脚肿,湿痹,轻身”,列为下品。宋代《本草衍义》记载:“夏枯草……,初生嫩叶时作菜食之,须浸洗淘去苦水”,表明其食用历史源长。现代临床研究表明夏枯草主要通过三萜类、黄酮类、酚酸类及香豆素类等次生代谢产物来发挥控制血糖,降低血压,消炎、抗过敏、抗病毒等作用。由于夏枯草在临床及饮食上的大量使用,因此而产生的供需矛盾不断加大。虽然全国有很多种植基地,但由于生态环境的变化,尤以非生物胁迫为主（盐胁迫是非生物胁迫中重要因素之一）,造成夏枯草活性成分的积累也随之改变,其质量控制与品质评价面临新的挑战。夏枯草为一广布的耐盐中药资源,盐胁迫环境与夏枯草药材品质密切相关,适度盐胁迫可促进夏枯草有效成分的合成与积累,提高其药材质量。然而,在夏枯草品质形成过程中,盐胁迫如何影响夏枯草次生代谢产物的合成与积累及其响应盐胁迫机制至今尚不清楚,因而,如何阐明盐胁迫下夏枯草的品质形成机制己成为夏枯草品质提升工程中的关键问题。本论在对夏枯草品质评价研究的前提下,依据盐胁迫诱导转录组、蛋白质组的差异表达而影响次生代谢物合成积累的规律,从盐胁迫与次生代谢物之间连接的纽带入手,借助系统生物学的优势和特点,以植物代谢组学技术筛选代谢差异标志物,结合蛋白质组学技术筛选差异表达蛋白质和转录组测序技术分析基因差异表达的研究模式,探讨盐胁迫环境下夏枯草次生代谢物差异成因及其药材品质形成的内在机制。对以后研究盐胁迫对药用植物中次生代谢物合成积累影响的分子机制及其品质形成机制具有推广示范意义。课题主要研究内容及结果如下:1.夏枯草中多元活性成分分析采用高效液相色谱-串联三联四极杆质谱联用技术（HPLC-QTRAP-MS/MS）对不同产地和不同生长期夏枯草中9个酚酸、3个香豆素、8个黄酮类化合物和1个五环三萜化合物同时分析。结果显示在不同产地、不同生长期夏枯草样品中,21个成分的总含量分别在986.04～2276.99μg/g和805.22～1806.9μg/g之间,其中生长期含量顺序为:枯萎期>凋亡期>开花期>萌芽期。根据21个成分的含量,采用层次聚类分析（HCA）和灰色关联分析（GRA）法对夏枯草质量进行综合评价。结果表明,安徽省种植的枯萎期夏枯草品质优于其它品种,结果与夏枯草的道地产地及传统采收期认知相吻合。从而为夏枯草药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考。2.盐胁迫对夏枯草生理指标及活性成分的影响采用植物生理分析方法对不同浓度盐胁迫下（0、50、100和150 mM）夏枯草光合色素（叶绿素和类胡萝卜素）、渗透平衡物质（可溶性糖、蛋白质和脯氨酸）、脂质过氧化产物（丙二醛）的变化以及抗氧化酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶）和抗坏血酸等生理生化指标进行测定。结果表明,高盐（150mM）处理显著抑制了植株的发育,且中高浓度下夏枯草存活率降低。低中高浓度三组中,光合色素持续降低。可溶性糖、蛋白与对照组相比有所增加,在中浓度盐处理组中达到最高值。脯氨酸、丙二醛、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶均随着盐浓度的增加而持续升高。而抗坏血酸在中浓度时最高,在高浓度盐胁迫时显著降低。采用HPLC-QTRAP-MS/MS和多元统计方法,对盐胁迫下夏枯草中多元活性成分的变化进行检测和分析。结果,不同浓度盐处理下夏枯草的质量顺序为:100 mM组>150 mM组>50 mM组=0 mM组。综合生理指标及多元活性成分含量结果显示100 mM盐胁迫下夏枯草品质最佳。3.盐胁迫下夏枯草的转录组学分析采用RNA-seq技术对盐胁迫下夏枯草的转录组变化进行分析,用Trinity软件对所有库的reads进行组装,得到118664个unigene。经过Uniprot、eggnog、GO、KEGG、Pfam、signalP、TMhmm七大主流数据库筛选找出68119个有功能注释的序列。根据|log2FC|≤1并且FDR≤0.01的条件,与对照组对比筛选出3857个差异表达基因,其中2456个上调,1401个下调。GO分析表明,盐胁迫相关基因主要在“催化活性”、“结合”、“代谢过程”和“细胞过程”等功能上富集。KEGG分析显示,盐胁迫及多元活性成分相关基因主要富集在参与运输、氧化还原酶活性、环境适应、次生代谢物的生物合成和转录相关通路上。取10个相关差异基因进行实时定量PCR检测其表达水平,结果与RNA-sep数据相一致。4.盐胁迫下夏枯草的蛋白质组学分析采用iTRAQ技术对不同盐胁迫条件下夏枯草进行蛋白组学分析,分析不同浓度盐胁迫下夏枯草蛋白质组表达水平差异,对差异蛋白质进行GO、STRING和KEGG分析。结果显示,检测到1937个蛋白质,在可分析蛋白基础上,选取Ratio≥1.3为上调差异蛋白,Ratio≤50.77为下调差异蛋白。结果显示,与对照组相比三组差异蛋白共440个,其中50 mM组66个上调,132个下调,100 mM组80个上调,98个下调,150 mM组142个上调,202个下调。Venn分析得到盐胁迫下共同表达的83个差异蛋白。在GO、STRING和KEGG联合分析的基础上,筛选出35个与夏枯草耐盐及次生代谢产物形成机制相关的目标差异表达蛋白。功能分析结果表明,盐胁迫下夏枯草细胞蛋白质和碳水化合物代谢较弱,钙离子转运较高,光合作用较强,蛋白质和次生代谢产物的合成比正常条件下快。5.盐胁迫下夏枯草的代谢组学分析采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF-MS）技术,对不同盐胁迫下夏枯草的代谢变化水平进行研究。与对照组相比,50、100和150 mM盐胁迫组分别筛选出146、175和159个差异表达代谢物,上调和下调表达的代谢物分别为48/97、76/99和55/10,其中最显著的上下调代谢物分别是3,4-二甲氧基肉桂酸、肌酸、三甲胺N-氧化物/Tyr-Leu、脱氧核糖、2’-脱氧腺苷5’-单磷酸（dAMP）;去甲脒酮、DL-苯丙氨酸,赖氨酸-苯丙氨酸/顺-9-棕榈烯酸、肉豆蔻酸、别嘌呤醇核苷;吡哆胺（PM）、氧化三甲胺、N-α-乙酰-L-精氨酸/3,4-亚甲基二氧亚甲基苯丙胺、L-岩藻糖-1-磷酸和酮亮氨酸。进一步代谢物鉴定和代谢通路综合分析表明,在盐胁迫下,差异代谢物主要富集在丙氨酸、天冬氨酸谷氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和嘌呤代谢等生物通路。6.盐胁迫下夏枯草的组学关联分析使用Rstudio平台,spearman相关性分析算法,对夏枯草转录组学,蛋白质组学和代谢组学进行了关联分析。发现夏枯草在盐胁迫下通过三个水平进行响应,通过氨基酸生物合成、碳代谢等来调节盐胁迫引起渗透变化,通过ABC转运体、光合作用的变化调节盐胁迫引起的离子毒性和氧化胁迫,还通过赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢影响的更复杂通路来响应盐胁迫。通过关联分析发现了由LYC608t00004调控的关键轴,LYC68t000004与Solyco9g0145202,psbC,psbD和GSCOCT00027397001蛋白呈负相关,其中psbC,psbD是调节光合作用的关键蛋白,说明LYC 68t000004可能参与了盐胁迫下夏枯草光合作用的调控。各组学的KEGG关联分析发现代谢通路（ath01100）和次生代谢产物的生物合成通路（ath01110）是响应盐胁迫的两个基本通路,结合夏枯草主要活性次生代谢产物与盐胁迫下差异蛋白、差异基因映射到共同代谢通路的结果分析,推测Esi00030214可能是伞形酮生物合成的关键酶。