本论文研究工作得到了国家自然科学基金资助项目——基于体内代谢机制的灯盏乙素苷元结构修饰、构效关系及生物利用度研究(No.81001382)的资助。本论文分为四个章节讨论。一、文献研究本部分对相关文献进行整理,综述了灯盏细辛资源利用、化学成分、药理作用及临床应用和灯盏乙素苷元的研究目的、研究方法和研究意义。二、灯盏乙素苷元体内过程研究(一)大鼠灌胃灯盏乙素苷元血浆、尿液和粪便中主要代谢产物的鉴定本部分采用超高效液相与四极杆-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术,利用碰撞能量梯度(MSE)和质量亏损过滤(MDF)技术对大鼠灌胃灯盏乙素苷元后在血浆、尿液和粪便中灯盏乙素苷元及其代谢产物进行了分析。结果显示,在大鼠尿液中可检测到灯盏乙素苷元(M1)、野黄芩素-5-0-β-D-葡萄糖醛酸苷(M2),野黄芩素-6-O-p-D-葡萄糖醛酸苷(M3),灯盏乙素(M4)、野黄芩素二葡萄糖醛酸苷(M5)、芹菜素葡萄糖醛酸苷(M6)、野黄芩素-4’-O-硫酸酯(M7)、野黄芩素甲醚(M8)和野黄芩素葡萄糖醛酸苷甲醚(M9)；在血浆中可检测到M1、M2、M4和野黄芩素乙酸酯(M10)；在粪便中没有发现原型药物,仅有1个Ⅱ相代谢产物(M10)。提示灯盏乙素苷元在大鼠体内可能主要以葡萄糖醛酸化、脱氧葡萄糖醛酸结合、硫酸化、甲基化、乙酰化等形式代谢。(二)灯盏乙素苷元在正常和模型大鼠体内的药动学及组织分布研究本部分建立了大鼠体内灯盏乙素苷元的UPLC-MS测定方法,研究正常和模型大鼠分别灌胃和尾静脉给药后灯盏乙素苷元的药动学及组织分布特性。采用反复双侧颈总动脉结扎建立大鼠脑部缺血再灌注模型,分别等剂量灌胃和尾静脉注射灯盏乙素苷元34mg-kg-1, UPLC-MS测定体内灯盏乙素苷元和灯盏乙素及组织中灯盏乙素苷元的浓度。结果显示,血浆中灯盏乙素苷元(1.05-1.05×104ng·mL-1)及代谢产物灯盏乙素(2.38-2.38×103ng·mL-1)线性关系良好。灯盏乙素苷元在正常大鼠中生物利用度为2.57%,而在模型组大鼠中生物利用度为3.22%。提示,在病理状态下,有利于灯盏乙素苷元生物利用。灯盏乙素苷元在脑中含量最高,其次是肾、脾、心脏、肺和肝脏。三、灯盏乙素苷元抗脑缺血有效性及作用机制初步研究(一)灯盏乙素及苷元与牛血清蛋白的结合及分子对接研究本部分采用平衡透析法和高效液相色谱法测定灯盏乙素和灯盏乙素苷元与小牛血清蛋白的结合率。同时采用荧光光谱法研究药物与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。采用标记竞争实验和分子对接技术研究药物与血清蛋白的结合位点。结果显示,灯盏乙素和灯盏乙素苷元与小牛血清蛋白之间结合率分别为(79.85±1.83)%和(85.49±1.21)%。灯盏乙素和灯盏乙素苷元与BSA的结合猝灭机制均是静态淬灭。热力学参数表明,范德华力和氢键是灯盏乙素和灯盏乙素苷元与BSA之间的主要作用力,其中,灯盏乙素苷元更容易与BSA相结合。标记竞争实验发现灯盏乙素和灯盏乙素苷元主要结合在BSA的ⅡA。此外,分子对接实验表明,一个BSA可以结合三个灯盏乙素苷元,而一个BSA只可以结合两个灯盏乙素。提示灯盏乙素和灯盏乙素苷元与小牛血清发生中等以上强度的结合,此外,灯盏乙素苷元比灯盏乙素蛋白结合力强。(二)灯盏乙素苷元对脑缺血损伤的保护作用本部分探讨了灯盏乙素苷元预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用。首次采用HILIC模式下的UPLC-MS/MS技术建立无需衍生化直接测定缺血脑组织中内源性氨基酸的含量测定方法,通过试剂盒测定大鼠缺血脑组织中Ca2+浓度和Ca2+-ATP酶活性。结果发现在17min内同时测定脑缺血再灌注大鼠缺血脑内谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)和γ-氨基丁酸(7-GABA)等17种氨基酸类神经递质的含量。各氨基酸标准曲线在检测范围内均呈良好的线性(r2>0.9999)。与假手术组相比,脑缺血再灌注组大鼠缺血脑组织中Glu、Asp、Gly等兴奋性氨基酸含量显著升高,而γ-GABA、Tau等抑制性氨基酸亦明显升高。而细胞内Ca2+浓度和Ca2+-ATP酶活性显著升高。灯盏乙素苷元预处理组能显著降低兴奋性氨基酸,Ca2+浓度含量和Ca2+-ATP酶活性,而抑制性氨基酸含量相应有所升高。与等剂量灯盏乙素组相比,灯盏乙素苷元具有更显著的差异。灯盏乙素苷元可能通过调节大鼠缺血再灌注后的氨基酸代谢紊乱,减轻钙超载,降低Ca2+-ATP酶活性,发挥保护脑组织,减轻缺血再灌注损伤的作用。(三)不同灯盏乙素及苷元的剂量对实验性脑缺血的保护作用及量效关系研究本部分主要探讨不同剂量的灯盏乙素及灯盏乙素苷元治疗大鼠反复缺血再灌注损伤的量效关系。灯盏乙素和灯盏乙素苷元(0.09,0.17,0.35,0.70,1.40mmolkg-1)连续灌胃7d后,采用反复双侧颈总动脉结扎造成大鼠脑缺血再灌注模型,观察脑组织病理改变、脑含水量和脑组织中Na+, K+, Ca2+, MDA含量及SOD, Ca2+-ATPase和Na+,K+-ATPase活性,采用HILIC模式下的UPLC-MS/MS技术直接测定缺血脑组织中内源性氨基酸。结果与模型组相比,灯盏乙素和灯盏乙素苷元预处理能够改善神经细胞损伤,减轻脑水肿,提高SOD活力,降低MDA含量。调节谷氨酸(Glu),天门冬氨酸(Asp),甘氨酸(Gly),γ-氨基丁酸(GABA)和牛磺酸(Tau),提高Ca2+-ATPase和Na+,K+-ATPase活性。提示灯盏乙素和灯盏乙素苷元可改善缺血再灌注神经损伤,可能通过清除自由基,抑制脂质过氧化物的生成,调节兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸,发挥保护脑组织的作用。同时灯盏乙素苷元的保护作用要好于灯盏乙素,灯盏乙素苷元最有效剂量为0.35mmol·kg-1.(四)灯盏乙素苷元调控脑缺血潜在生物标志物的机制研究通过对缺血再灌注损伤的代谢组学研究,确定能够表征缺血性脑损伤发生、发展和恢复状态的生物标记物,并基于此标记物的代谢轨迹变化阐述灯盏乙素和灯盏乙素苷元脑损伤的保护作用。采用反复双侧颈总结扎,建立大鼠脑缺血再灌注模型,将大鼠分为假手术组、模型组、尼莫地平组、灯盏乙素和灯盏乙素苷元组。基于代谢组学理论,采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)方法,对大鼠尿液、血浆和脑组织中内源性代谢成分进行分离测定,以主成分分析方法为数据分析方法。通过独特通路分析(MetPA),构建代谢组学特征网络图。初步鉴定出对模型组和空白组的分类具有显著贡献的23个潜在的生物标志物(尿液中9个,缺血脑组织中8个和血浆中6个)。通过代谢通路分析,在尿液中11条代谢通路,缺血组织中14条代谢和血浆中3条代谢通路被发现。这些内源性代谢产物主要参与了sphingolipid metabolism, lysine biosynthesis及alanine, aspartate和glutamate metabolism.灌胃灯盏乙素和灯盏乙素苷元后,紊乱的代谢产物含量恢复到健康水平。此外,通过PLS-DA score plots图中相对距离分析,灌胃灯盏乙素苷元后疗效好于灯盏乙素。灯盏乙素和灯盏乙素苷元可能通过参与调节的sphingolipid metabolism, lysine biosynthesis及alanine, aspartate和glutamate metabolism来保护缺血性损伤。四、灯盏乙素苷元代谢稳定衍生物的合成本部分基于灯盏乙素苷元良好的神经保护作用,而体内易于代谢的特点,结合前期实验研究,以灯盏乙素苷元为先导化合物,研究设计了A环上8位氢的结构修饰路线,合成制备了磺酸化和噁嗪骈灯盏乙素苷元衍生物。采用体外清除DPPH自由基活性和对Fe3+还原能力对衍生物进行活性评价。