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第一部分目的:本课题旨在探究白藜芦醇在肾小管上皮细胞氧化损伤中的作用及分子机制。方法:(1)以不同浓度过氧化氢(100u M、250u M、500u M、750u M)诱导HK-2细胞48H,采用CCK-8检测细胞的活性;(2)以250u M过氧化氢诱导HK-2,同时加入不同浓度的白藜芦醇(5u M、10u M、20u M)作用48H后,运用CCK-8发检测细胞活性;(3)以250u M的过氧化氢及10u M Res作用于HK-2 48H后,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western Blot检测DNA断裂标志物Y-H2ax、P-Akt的表达情况。结果:(1)CCK-8检测结果显示随着过氧化氢浓度逐渐升高,细胞活性呈递减趋势,P<0.05;(2)CCK-8检测结果显示随着白藜芦醇(5u M、10u M、20u M)浓度的上升,细胞活性逐渐下降,P<0.05;(3)Western Blot结果显示,单纯给予250u M的过氧化氢后DNA断裂标志物Y-H2ax的表达显著增加;同时给予过氧化氢及10u M的Res处理后,DNA断裂标志物Y-H2ax表达水平进一步增加;单纯给予10u M的白藜芦醇后DNA断裂标志物Y-H2ax明显增加。(4)流式结果显示单纯给予250u M的过氧化氢凋亡率为56.7%;同时给予250u M的过氧化氢及10u M Res后,细胞的凋亡率增高至69.1%。(5)Western Blot结果显示,单纯给予过氧化氢时P-Akt显著上调;同时加入250u M过氧化氢与10u MRes时P-Akt显著下调;单纯给予Res时,P-Akt显著下调。我们进一步研究,在过氧化氢诱导的损伤中加入10u M MK-2206(Akt抑制剂),发现过氧化氢诱导的损伤进一步加重。结论:Res在过氧化氢诱导的肾小管上皮细胞的损伤过程中并非起着保护着作用而是起着进一步促进细胞的损伤.Res诱导Akt的下调在促进过氧化氢诱导的损伤过程中起着重要的作用。第二部分目的:进一步探讨Res诱导HK-2细胞的损伤及其机制方法:(1)以不同浓度的Res(5u M、10u M、20u M)作用HK-2细胞48H后,CCK-8检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western Blot检测相关蛋白的表达。(2)以浓度为10u M的Res作用HK-2细胞,48H后流式细胞仪检测活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)及线粒体膜电位,Western Blot检测相关蛋白的表达;(3)以10u M N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)和10u M的Res同时作用48H,流式检测ROS及细胞凋亡情况。(4)以10u M的Caspase抑制剂(一种细胞渗透性的,不可逆泛caspase抑制剂,Z-VAD-FMK,FMK)与10u M的Res同时作用48H后,流式检测细胞凋亡率。(5)免疫荧光检测Cytc弥散情况。结果:(1)CCK-8结果显示,随着Res浓度的的递增细胞计数逐渐下降;流式结果显示,随着Res的升高细胞的存活率呈下降趋势,细胞的凋亡率呈递增趋势,P<0.05;Western Blot结果显示,随着Res的浓度升高DNA断裂标志物Y-H2ax呈现逐渐升高的趋势。(2)流式结果显示,与对照组比较,Res组的ROS水平显著升高,线粒体膜电位显著降低,P<0.05。(3)流式结果显示,NAC使得Res诱导的活性氧显著下调,P<0.05,而对HK-2细胞凋亡率无显著影响,P>0.05。(4)结果显示,与Res组比较,给予FMK后,细胞凋亡率明显减少,P<0.05。(7)给予10u M Res孵育48H后行细胞色素c(Cytochrome c,Cytc)免疫荧光染色显示,Con组线粒体明显多于Res组,同时con组未见Cytc弥散出线粒体外,而Res组可见线粒体数量显著减少,且线粒体内的Cytc弥散出线粒体外(8)给予10u M的Res,进一步研究发现,P53及乙酰化P53升高,P53的下游蛋白Noxa、Bax、Bcl2的表达并没有升高,而其下游蛋白Bcl-xl的表达降低,而Puma的表达上调。(9)给予不同浓度的P53(10u M、5u M、1u M、0.5u M)抑制剂Pifithrin-α(PFTα),48H后检测细胞活性,显示1u M PFTα对细胞活性没有差异,P>0.05,给予Res组加入1u M PFTα48小时后检测细胞凋亡率。发现P53抑制后细胞的凋亡率也没有差异,P>0.05。(10)加入Sp600125(SP600125是一种广谱JNK抑制剂,作用于JNK1,JNK2和JNK3,Sp)发现,给予1u M时Sp细胞活性没有受到抑制。Res组给予1u M48H检测细胞凋亡率,发现细胞凋亡率显著下降,P<0.05。我们随着检测了P-jnk蛋白的表达,Res组相比Con组的P-jnk明显上调。结论:肾小管上皮细胞(HK-2细胞)单纯给予Res时,会诱导肾小管上皮细胞损伤,且随着Res的浓度递增损伤呈加重趋势,即HK-2细胞的损伤程度与Res的浓度成正比。Res引起ROS的升高及JC-1的下降并不是引起细胞凋亡坏死的诱因,只是Res诱导细胞损伤过程中的伴随症状。给予FMK后,细胞凋亡率显著减少,p,由此可见依赖Caspase途径的凋亡在Res诱导细胞凋亡过程中起着重要的作用。Western blot显示cleave-Caspase3显著上调,免疫荧光显示给予Res诱导的HK-2细胞损伤,可见线粒体内的Cytc弥散在线粒体周围。进一步研究发现发现P53及Ac—P53蛋白明显上调,其依赖P53凋亡蛋白Puma上调,bcl-xl蛋白下调,但是给予1u M的PTFα后,细胞凋亡并没有显著的差异,P>0.05,由此可见Res诱导的HK-2细胞的损伤并非是通过P53信号通道调节的细胞的凋亡。而在给予1u M的Sp后,可见细胞的凋亡率显著减少,P<0.05,western Blot显示P-JNK显著上调。由此可见通过Jnk诱导的死亡在Res诱导的HK-2细胞损伤中过程中起着重要的作用。