研究背景与目的乳腺癌是一种由乳腺导管和乳腺小叶内细胞增殖和分化异常引起的一类复杂疾病,主要发生在女性人群,男性中十分少见。绝大多数的乳腺癌呈现一种散发的趋势,同时也具有一定的遗传倾向。乳腺癌每年有一百万的新生病例,是女性中最常见的恶性肿瘤。发达国家中乳腺癌的患病率占所有癌症的10%,占所有女性癌症患者的23%。实验数据表明超过15%的健康女性与乳腺癌轻度相关,目前女性罹患乳腺癌的风险增加了一倍以上,有乳腺癌家族始的女性患乳腺癌的风险同样增加。尽管目前乳腺癌的诊断和综合治疗都有所改善,但在诊断和治疗方面均存在一定的问题。在诊断方面,乳腺癌的诊断主要依赖于影像学手段,如钼靶射线、超声和MRI等,但是其对乳腺癌的远处播散和血液循环中的微扩散检测能力不够。在乳腺癌的早期诊断方面主要依赖癌胚抗原(carcino-embryonic antigen, CEA). CA153等糖蛋白生物标志物,其在肿瘤早期很难检出,且易受患者体内非瘤因素(如高热、生物钟等)的影响,同时CEA在多种肿瘤中均可见异常表达,因此特异性和灵敏度均不高。在治疗方面,包括外科联合治疗、放射治疗和化疗等,能够改善患者的预后,但化疗药物耐药及癌症转移依然是癌症治疗中的突出问题。由于化疗耐药性或细胞扩散引发癌症复发或者远处播散致使传统的治疗方式效果不佳,迫切需要选择新型有效的诊断和治疗策略。大量的研究表明,EZH2(Enhancer of zeste homolog2)在乳腺癌中高表达,是浸润性乳腺癌的重要生物学标志物。EZH2定位于7q35-6,在基因组中覆盖20个外显子,人EZH2蛋白由746个氨基酸组成,其中存在一个富含半胱氨酸的结构域称为pre2SET结构域,该结构域的存在与甲基化转移酶活性密切相关。EZH2的主要功能是催化组蛋白H3第27位赖氨酸残基(H3K27)发生三甲基化,调节影响细胞基本功能,在维持成熟细胞和胚胎干细胞的自我更新过程中发挥着重要的作用。EZH2是一种具有广泛的双相转录调节因子的原癌基因,该调节功能主要表现在通过自身甲基化转移酶的作用沉默肿瘤抑制基因,这些肿瘤抑制基因主要参与肿瘤形成和癌症末期基因的反式激活。基因EZH2在多数癌症中高表达,其中包括乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、恶性间叶肿瘤和淋巴癌。高表达的EZH2往往与肿瘤发展的晚期和预后差相关。有研究表明EZH2的调节失调可能是肿瘤发生、发展过程中一个重要的启动因子,而且在乳腺癌干细胞中EZH2可以通过诱导RAF1-ERK-β-catenin信号通路增强干细胞的增殖和存活能力,因此EZH2的失活可能称为许多癌症的有效治疗手段。另EZH2蛋白表达增多与三阴性乳腺癌和低生存率明显相关,EZH2可能是治疗该疾病的潜在靶点。因此可认为EZH2在乳腺癌的诊断和治疗中都发挥着十分重要的作用,但是乳腺癌中EZH2基因高表达的机制仍不清楚。MicroRNAs (miRNAs)是一类内源性非编码RNA,长度约18-25个碱基,主要功能是参与基因表达的转录后调节。成熟的miRNAs进入RNA诱导复合物,通过nRNA降解、翻译抑制和miRNAs介导的mRNA衰退等机制调控基因表达。目前认为人类基因组含有1000多个niRNAs,已经分离和测序鉴定了700多个miRNAs。每一种niRNA可以靶向调节多种基因,52.5%的niRNAs位于癌症相关的基因组序列。因此,miRNAs是体内广泛存在的基因调节因子。miRNAs主要通过与靶基因的3’非编码区(untranslated region, UTR)结合引起靶基因的翻译抑制和降解,从而在转录后水平调解靶基因的表达。根据所影响的靶基因的功能miRNAs可作为原癌基因或者肿瘤抑制基因。目前研究显示,miRNAs的表达呈现时间-空间和组织的特异性,即miRNAs在特定的组织细胞和特定的时间内表达,其功能涉及细胞生命活动的多个方面,诸如分化、增殖、凋亡、血细胞形成、神经发育和肿瘤形成等。随着人们对miRNAs功能的深入了解,其在乳腺癌的发生发展的研究也日益得到重视。已经发现多种niRNAs在乳腺癌中表达异常,如miR-21,miR-34a,miR-101等,这些miRNAs均参与肿瘤的进程。同时也发现多种miRNAs可以参与调解EZH2的表达,如miR-26a, miR-101, miR-138和miR-214等。但仍存在其它可以调控EZH2的miRNAs。本研究主要是利用miRNAs与靶基因3’UTR结合的特性,以前期本课题组成功构建的重组EZH23’UTR乳腺癌细胞MCF-7及其相应对照一重组空miRNA筛选载体的MCF-7细胞为基础,筛选靶向EZH23’UTR的miRNAs,并验证基因EZH23’UTR上存在筛选出的1niR-15b的结合位点,niR-15b可以通过此结合位点影响EZH2的蛋白表达。方法1.按照试剂说明使用感染复数分别为1、5、10的慢病毒文库阳性对照CD511VB-1转染重组EZH23’非翻译区的MCF-7细胞株,荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况选择慢病毒文库感染细胞的最佳感染复数。2.重组EZH23’非翻译区的MCF-7细胞株在感染增强剂polybrene的协助下感染miRNAs慢病毒文库,利用细胞毒性药物筛选感染文库后的细胞,筛选结束后进行酚氯仿法细胞基因组抽提。以抽提基因组为模板通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增得到miRNAs前体片段,将扩增片段通过T-A克隆连接至pMD-19T载体上,测序确定miRNAs种类。3.TRizol法对13对乳腺癌及癌旁组织和乳腺癌细胞MCF-7及正常乳腺上皮细胞HBL-100进行RNA抽提,并对筛选出的miRNAs进行颈环引物设计。在13对乳腺癌组织和乳腺细胞株中对筛选出的miRNAs进行反转录(reverse transcription, RT) PCR定量分析,检测乳腺癌组织和乳腺细胞中筛选出的miRNAs的表达情况,寻找差异表达的miRNAs进行靶点验证实验。4.应用过表达抑制技术,验证miR-15b可以调节EZH2的蛋白表达。首先检测细胞株中miR-15b的表达情况,在低表达miR-15b的细胞株中加入miR-15b mimics,在高表达细胞株中加入miR-15b inhibitor,过表达和抑制后通过Western Blot技术检测EZH2的表达。5.利用双荧光素酶表达系统进行靶点验证实验。通过PCR在人cDNA中扩增得到野生型和突变型EZH23’UTR,连接至pMD-19T载体上。测序成功后双酶切连接至psi-CHECK2载体上,构建含野生型和突变型EZH23’UTR的双荧光素酶表达载体,分别与niR-15b mimics共同转染人胚肾293T细胞。转染结束后检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。观察细胞和组织中表达存在差异的miR-15b是否可以通过直接与EZH23’UTR结合影响荧光素酶的活性。6.数据处理和统计均用SPSS13.0统计软件进行分析,所有计量资料用均数±标准差(x±S)表示,两组间比较采用t检验；目的基因的表达根据标准曲线得出niRNA的分子拷贝,采用U6snRNA基因作为内参照,用U6snRNA的拷贝数作为校正基数,即目的基因miRNA相对表达量=目的基因拷贝数/U6snRNA拷贝数。结果1.感染复数分别为1、5、10的慢病毒文库阳性对照CD511VB-1感染重组细胞株三天后,荧光显微镜下观察随着感染复数增加细胞表达绿色荧光蛋白的量逐渐减少,因此选择感染复数为1进行重组细胞株的感染。2.MiRNAs慢病毒文库以感染复数为1进行重组MCF-7细胞株感染,成功感染后,加入细胞毒性药物进行药物筛选。药物筛选10天后,酚氯仿法对各组存活细胞进行基因组抽提,以此为模板进行PCR扩增并测序后共得到7种miRNAs,分别为miR-217、miR-15b、miR-16-2、miR-329-1、miR-181b-2、miR-224和miR-487b。3.RT-PCR对比发现在乳腺癌细胞MCF-7及正常乳腺上皮细胞HBL-100中miR-217, miR-329-1, miR-487b在正常乳腺上皮细胞HBL-100中高表达,miR-15b、 miR-16-2、miR-181b2和miR-224在乳腺癌细胞MCF-7中高表达。组织中的定量检测发现,miR-15b和miR-16-2相比癌旁组织而言在乳腺癌中低表达,差异有统计学意义(P<0.05),其它差异无统计学意义。4.在细胞株HBL-100、MCF-7和MDA-MB-231中对miR-15b进行检测发现,三细胞中miR-15b在MCF-7中表达最多,在HBL-100中表达最少。因此选择在MCF-7中进行miR-15b抑制实验,在HBL-100中进行miR-15b过表达实验。以10nM miR-15b mimics和80nM miR-15b inhibitor分别转染HBL-100和MCF-7后Western Bloting结果显示EZH2蛋白随着miR-15b的增多逐渐减少,反之增多。5.PCR扩增得到的野生型和突变型EZH23’UTR经测序均与预计相同。双酶切后连接至双荧光素酶载体上,成功构建野生型EZH23’UTR的双荧光素酶表达载体(wt-EZH2)和突变型EZH23’UTR的双荧光素酶表达载体(mt-EZH2)。实验组或对照组载体与miR-15b共转染细胞,检测发现与突变型载体相比野生型载体荧光素酶的相对活性减弱。结论成功利用前期构建的重组MCF-7细胞株结合miRNAs慢病毒文库和细胞毒性药物筛选出靶向EZH23’UTR的7种新型miRNAs。过表达和抑制实验证明miR-15b可以影响EZH2的表达,并通过双荧光素酶表达系统证实EZH23’UTR上存在miR-15b的结合位点,进一步证明构建的筛选系统可以发挥作用。对重组细胞株中的载体进行改变可以用以筛选靶向意向基因的miRNAs。另一方面对miR-15b和EZH2进一步研究可能对了解EZH2在乳腺癌中过表达的原因和机制以及miR-15b对乳腺细胞功能的影响有重要的意义。