糖广泛分布在自然界中的各种生物体中,并且发挥许多重要功能；其在生物体主要以糖缀合物的形式存在,与蛋白质、脂等物质共价键相连,形成糖蛋白／蛋白聚糖、糖脂等缀合物。糖链中单糖糖基间糖苷键形成的位置、构型的不同、以及糖链修饰方式的不同,赋予糖缀合物高度多样性和异质性；不同细胞、组织器官所具有的多样的糖缀合物赋予各细胞、组织器官不同的表型及功能。细菌细胞表面存在由诸多糖缀合物组成的糖萼,在细胞黏附及定植过程中发挥重要作用,并且能保护细菌自身免受其他生物体的攻击；值得关注的是,细菌表面糖组份具有抗原性,如存在于革兰氏阴性菌表面的脂多糖,可介导宿主细胞产生免疫反应。据此,细菌表面的多糖抗原成为致病菌疫苗研发的关注点。脂多糖,存在于革兰氏阴性菌细胞表面,由脂质A、核心寡糖及O-多糖组成；O-多糖(O-polysaccharide, O-PS),亦称之为O-抗原,脂多糖的最外层结构,是机体免疫系统识别的重要靶点；O-抗原是细菌多糖疫苗研发的主要依据；同时,O-抗原具有较高的变异性,不同的菌种其O-抗原结构不同,因此,据此研发的多糖疫苗广谱性差。核心寡糖,连接O-抗原与脂质A,其糖链结构与O-多糖相比,在菌种之间相对保守,并具有一定的抗原性,可作为广谱性多糖疫苗研发的候选成分。根据糖链结构的不同,E. coli的核心寡糖分为四种类型：R1、R2、R3及K12,其中R3结构存在于多种肠出血性大肠杆菌。值得注意的是,糖抗原疫苗所触发宿主的免疫反应是不依赖于T细胞的,几乎不产生IgG抗体以及无免疫记忆,免疫活性的持续性差,需提高糖抗原疫苗的免疫原性。细菌表面多糖除具有抗原性以外,也有其他活性表现,例如,研究证实的大肠杆菌086：B7的O-抗原结构与人类血型抗原B抗原结构相似,具有B抗原活性。ABO血型系统是人类最重要的血型系统。当血型抗原A/B输入带有相对应血型抗体抗A/抗B人体内时,血型抗原与相应血型抗体结合,即出现ABO血型不兼容(ABO-incompatible, ABOi),可导致红细胞聚集和破裂,甚至死亡;去除血浆中抗A或B抗体可降低ABOi导致的超急性排斥反应和移植物坏死。目前,去除血型抗体常用的方法是用A/B血型抗原作为免疫吸附剂,特异性的吸附去除血型抗体。然而,血型A/B抗原的获得方式有限,并且难固定化,这成为免疫吸附法应用的瓶颈。A/B抗原主要通过化学方法合成或酶法合成获得。化学合成步骤繁多,形成特定立体构型糖苷键是难点；酶法合成,主要利用相应的糖基转移酶催化A/B抗原合成,但糖基转移酶来源有限,并且参与反应的活化的糖基供体价格昂贵,这些因素均限制了该方法的实际应用。因此,亟需找到一种高效、低廉的获得A/B抗原的途径。大肠杆菌086：B7可成为合成B抗原的细胞工厂。本论文的研究内容分为两部分。第一部分是大肠杆菌核心寡糖缀合物的合成及免疫学评价(第二章)；第二部分是MBPmut-OPS的合成及其吸附血型抗B抗体的应用(第三章)。第一部分：本章首先分析E. coli胞外脂多糖结构,尤其是核心寡糖R3的外核结构,R3的外核寡糖由五个单糖糖基组成,并具有分支结构,据此设计合理的化学反应方案,化学方法合成了R3外核寡糖的全五糖pentasaccharide结构；为提高多糖抗原的免疫原性,在糖链还原端添加丙基氨基连接器；通过活化的连接器将pentasaccharide与载体蛋白共价连接,合成了Pentasaccharide-CRM197 (Penta-CRM197)以及Pentasaccharide-BSA (Penta-BSA)两种糖缀合物；然后对这两种糖缀合物进行了定性定量分析。为明确Pentasaccharide-CRM 197的免疫活性,利用小鼠进行了体内实验。Pentasaccharide-CRM197为免疫抗原免疫小鼠,检测并分析其对小鼠的免疫活性。ELISA实验检测免疫小鼠血清抗pentasaccharide抗体滴度,结果显示,小鼠体内产生了高滴度的特异性的抗pentasaccharide寡糖的抗体,包括IgG和IgM,这提示Penta-CRM197可很好的刺激小鼠产生体液免疫应答,这也是评价疫苗免疫效果的重要指标之一。为进一步明确Penta-CRM197在小鼠体内所激活的Th细胞的类型,分析了Penta-CRM197免疫小鼠所产生抗体IgG的亚型。小鼠体内IgG亚型有IgG1、IgG2、IgG3等。IgG亚型各有不同的功能和特点(见表1.5),IgG亚型的不同可反应Th免疫应答的类型的不同(Thl型或Th2型)。在本实验中,Penta-CRM197可同时刺激Thl及Th2细胞应答,其中以Th2应答为主。为验证Penta-CRM197激活的免疫系统是否具有杀伤R3型致病菌的能力,本实验选取含有R3结构的致病菌E.coli 0157:H7作为对抗菌,进行了体外杀菌实验；结果显示,Penta-CRM197免疫血清对E. coli 0157:H7具有杀伤作用,免疫血清在稀释倍数≤160时,即可达到50%的杀伤率。综上所述,本实验设计并合成了一种新的糖缀合物,并可以在小鼠体内产生有效的免疫活性。本章内容为细菌多糖缀合物疫苗的设计及合成提供新的思路,也提示本实验合成的Penta-CRM197作为抗E. coli R3致病菌的疫苗的潜能。第二部分：细菌胞外多糖除上述的抗原活性,尚具有其他生物学活性；值得一提的是大肠杆菌086：B7的O-抗原,其结构与人类血型抗原B抗原结构相似,具有B抗原活性。鉴于目前B抗原获取的困难以及制备通用血型的迫切性,本实验设想将大肠杆菌086：B7作为B抗原的细胞工厂,合成具有B抗原活性的O-抗原,并将其缀合在载体蛋白上,以便于分离纯化。本部分中,大肠杆菌086：B7作为O-抗原合成的工厂,然而大肠杆菌086：B7不具有相关的糖基转移酶,不能将O-抗原缀合在特定蛋白上。为此,我们将空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, C.jejuni) N-糖基化系统导入大肠杆菌086：B7细胞内,该系统的糖基转移酶Pg1B是合成糖蛋白缀合物的关键；PglB催化糖链从萜醇类脂载体转移并连接在载体蛋白的天冬酰胺(N)残基上,该天冬酰胺残基须位于特定的氨基酸序列D/E-X-N-Y-S/T (X, Y≠P)中;在PglB的作用下,可将大肠杆菌086的O-抗原糖链连接于特定的载体蛋白上。本实验选取麦芽糖结合蛋白(Maltose-binding protein, MBP)为O-抗原的载体蛋白,MBP由malE基因编码,参与麦芽糖／麦芽糖糊精的转运,与麦芽糖／麦芽糖糊精具有高亲和力;在MBP肽链的N末端存在有引导其进入E. coli周质空间的信号肽,因此,MBP经常作为E. coli蛋白表达系统的融合标签,阻止蛋白包涵体的形成。在构建E. coliN-糖基化系统时,向E. coli导入的以上两种基因：C. jejuni糖基转移酶PglB的基因、MBP编码基因malE,分别使用的载体质粒是pACT3、pBAD24。由于MBP的氨基酸序列不存在PglB所需要的糖基化位点,因此对MBP基因malE的碱基序列进行了改造,在其表达MBP蛋白C端插入D/E-X-N-Y-S/T (X,Y≠P)_糖基化序列,将改产物命名为MBPmut°这样,Pg1B可以E. coli的O-抗原为糖供体,以MBPmut为蛋白供体,催化合成具有B抗原活性的MBPmut-O-抗原缀合物。为使E. coli的O-抗原更有效的连接与载体蛋白上,本实验通过Red重组系统(包括3个质粒：pKD4、pSIM19、pCP20),成功敲除了E. coli 086的waal基因,不能表达糖基转移酶Waal,导致E. coli 086不能将O-PS转移并连接在Lipid A-core的糖基上,使得O-PS在E. coli周质空间中积累,更好的为N-糖基化系统提供糖链供体。综上所述,本实验成功建立了E. coli N-糖基化系统,将具有B抗原活性的O-抗原呈现于载体蛋白MBPmut上,成功表达了MBPmut-OPS。经纯化得到的糖缀合物,经后续鉴定实验包括考马斯亮蓝染色检测、Western blot检测、MALDI-TOF检测结果证实是MBPmut-OPS,定量检测得出纯度达95%、纯化得率约为1.5 mg/L(蛋白定量)。通过Western鉴定,纯化得到的MBPmut-OPS具有人血型B抗原活性,并且,ELISA实验验证,MBPmut-OPS可特异性结合人抗B抗体,而没有检测到其与抗A抗体的相互作用；在此验证结果的基础之上,将MBPmut-OPS与人的A血型及O血型血浆相互作用,对比作用前后血浆中抗B抗体滴度,结果显示MBPmut-OPS能够有效的吸附血浆中的抗B抗体；并且进一步证实,该吸附作用对其凝血功能没有影响。综上所述,本章成功建立了E. coli O 86的N-糖基化系统,并诱导表达纯化得到了糖缀合物MBPmut-OPS;验证了其人血型B抗原活性,然后应用该糖缀合物有效去除了人血浆中的抗B抗体。本实验将改造的E. coli O 86作为合成具有B抗原活性糖缀合物的细胞工厂,为人血型B抗原的获取提供新方法；为通用血型的制备以及ABOi异体移植手术抗B抗体的去除提供新的思路,具有重要的临床意义及广阔的应用前景。