目的：龋病是世界范围内的常见病和多发病，被世界卫生组织列为要重点防治的三大疾病之一。而其中乳牙龋又是儿童常见的多发病，不仅直接破坏儿童的咀嚼器官，还可影响儿童全身的营养和发育，并导致颌面部发育障碍及各种口腔疾病，对小儿心理也造成不良影响。 本研究应用现代分子生物学技术对同一幼儿园不同龋敏感儿童口腔变形链球菌的基因型进行研究，探讨不同龋敏感儿童口腔变形链球菌临床分离株的遗传多态性与乳牙龋的关系，从而为获得完善龋危险性预测的方法及预防乳牙龋的发生提供有力的理论和实验依据，并为临床上快速检测龋易感者奠定实验基础。 方法： 1．选择泸州医学院附属医院幼儿园的50名3～5岁儿童，常规口腔检查，记录龋失补指数(decayed，missing，filledteeth index，dmft)、饮食情况、生活习惯和喂养史等。要求无全身系统性疾病，取样前三个月内未服用抗生素，取样前12小时内不刷牙。其中：无龋组18例，中龋组16例，高龋组16例。不同龋敏感儿童分别为：高龋者dmft≥6，中龋者6＞dmft≥4，无龋者dmft=0。用无菌刮匙刮取龋坏组织内及附近的菌斑，对无龋者刮取釉质窝沟及邻面的菌斑，将刮取的菌斑置于盛有0.5ml硫乙醇酸盐转送液的EP管中，并且用液体石蜡20 μl覆盖，迅速转运至实验室。标本经漩涡混匀仪振荡1 min，使菌斑细菌团块分散均匀，用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution，PBS)做10倍系列稀释后，分别接种于轻唾琼脂(Mitis Salivarius．Agar，MS)平板上，37℃，厌氧培养(80％N2，10％CO2，10％H2)72 h后，观察平板上菌落的生长情况，挑选菌落标准：形态为深蓝色嵌顿，质硬，表面粗糙，突起，边缘不齐的典型变形链球菌菌落，涂片，革兰氏染色，镜检证实为呈短链状、成对状或分散排列的变形链球菌后，将变形链球菌单个菌落接种于MS平板上，37℃厌氧(80％N2，10％CO2，10％H2)条件下进行次代纯培养，48 h后，肉眼观察无杂菌生长，镜检证实为纯培养后，再次转种至牛脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)液体培养基中进行增菌，18 h后，再次经镜检证实为纯培养后，收集细菌，保种于盛有0.5 ml含50％甘油的Big培养基的EP管中，parafilm封口，-20℃冷藏备用。 2．为了排除如血链球菌和远缘链球菌等在菌落形态上可能与变形链球菌混淆的细菌，每人随机挑取3～6株临床分离株，以变形链球菌ATCC25175为阳性对照组，PBS为阴性对照组，所有临床分离株经三次微量生化板进行鉴定，并用革兰氏染色法镜检，观察细菌形态，菌细胞形态呈短链状、成对状或分散排列。 3．提取细菌染色体的DNA，采用基因组DNA快速提取试剂盒分别提取每个分离株的DNA。由于提取得到的DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关，而且核酸抽提中常用的试剂都能使．A260和A280的值变大，但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致，因此测DNA的A260/A280比值可估计某一核酸溶液的纯度，取少量DNA在核酸蛋白测定仪下测定其浓度和纯度。以5-TGCCGAGCTG-3为引物，采用随机引物聚合酶链反应法(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP-PCR)对不同龋敏感儿童口腔变形链球菌临床分离株DNA进行扩增，反应总体积为25μl，其中包括20 mM Tris-HC1，每种dNTP各500μmol/L，3 mmol/LMgCl2，0.1 U Taq聚合酶，100 mM KCL，0.3 μmol/L引物，DNA 2～40 ng，不足部分用ddH2O补齐，以临床分离株染色体DNA为反应模板，在PCR扩增仪中进行循环反应。反应条件为：94℃预变性5 min，35个循环(94℃1 min，36℃2 min，72℃2 min)后，72℃延伸5 min。扩增完成后，取10 μl反应混合物进行1％琼脂糖凝胶(已加EB)电泳35～50 min，电泳液为TBE缓冲液，电压100～120 V，以Lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢ标记分子量参照标准，在凝胶分析仪上观察扩增产物带型。并以不同稀释度的变形链球菌临床分离株染色体DNA为模板，进行AP-PCR重复性的检测。 4．对不同龋敏感性的组别和其所携带不同种基因型的数量之间的关系用SPSS 13.0软件进行卡方分析。 结果： 1．经初代培养的50例个体的菌斑样本中，有29例个体培养出变形链球菌，检出率为58％，其中高龋者12例，占24％，中龋者9例，占18％，无龋者8例，占16％。培养皿中可观察到典型变形链球菌菌落形态即呈深蓝色嵌顿，质硬，表面粗糙，突起，边缘不齐的菌落，用革兰氏染色法镜检，菌细胞形态呈短链状、成对状或分散排列。21名未培养出变形链球菌的个体中，有15名是无龋个体，6名是中龋个体。经纯培养共获得纯培养变形链球菌29例共119株，其中无龋组8例35株，中龋组9例38株，高龋组12例46株。 2．由于血链球菌和远缘链球菌等在菌落形态上可能与变形链球菌相混淆，对119株变形链球菌临床株进行三次生化鉴定，结果在119株变形链球菌临床分离株中筛选出111株变形链球菌，其中无龋组8例31株，占27.93％；中龋组9例36株，占32.43％；高龋组12例44株，占39.64％。 3．111株变形链球菌DNA的A260/A280比值为1.7～1.9之间，说明提取的变形链球菌DNA浓度及纯度较高，蛋白质没有污染。采用AP-PCR对不同龋敏感儿童口腔变形链球菌临床分离株DNA进行扩增，电泳后在凝胶分析仪上观察扩增产物带型，肉眼观察如果10条带谱中有9条相同，即认为两个菌株的基因型相同。在所获取的111株变形链球菌临床分离株中，共有33种基因型，其中12例高龋个体中有2例为1种基因型，9例有2种基因型，1例有3种基因型；9例中龋个体中有8例为1种基因型，1例有2种基因型；8例无龋个体中全部为1种基因型。在确立的最佳AP-PCR反应条件下，用同一临床分离株染色体DNA为扩增模板，在不同时间，以不同稀释度的变形链球菌临床分离株染色体DNA为模板，进行AP-PCR重复性的检测，产生了相同的扩增产物带型，所得的电泳带型均一致。 4．对不同龋敏感性的组别和携带不同种基因型数量之间的关系用SPSS 13.0软件进行卡方检验，x2=19.325，P=0.001<0.01(α=0.05，υ=4)，具有统计学意义。 结论： (1)对符合标准的个体共50例，用MS培养基可获得纯培养变形链球菌29例共119株：无龋组8例35株，中龋组9例38株，高龋组12例46株。采用微量生化板法对29例共119株变形链球菌临床株进行生化鉴定，其中有111株为变形链球菌，无龋组8例31株，占27.93％；中龋组9例36株，占32.43％；高龋组12例44株，占39.64％。 (2)AP-PCR基因指纹技术能获得变形链球菌的条带模式图即基因指纹图谱，扩增的条带清晰；对在不同时间，以不同稀释度的变形链球菌临床分离株染色体DNA进行重复性检测发现AP-PCR重复性好。 (3)敏感性越高的组别其所携带的基因型的数量也越多，口腔菌斑中定植的变形链球菌所携带AP-PCR基因型的数量与其致龋性有关系。 (4)AP-PCR基因分型是一种经济、快速、可靠的基因分型方法，是在分子水平上对变形链球菌进行病原学、发病机理及流行病学研究较理想的工具。