本试验用H9亚型禽流感病毒FT株作为免疫原,免疫6周龄BALB/c雌性小鼠。加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,采用ELISA方法和HI方法筛选,阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养,最后获得6株抗H9亚型禽流感病毒特异性单克隆抗体(McAb),分别命名为1Dl0、4A7、4E4、4F3、4H12、5Blo。其中1Dl0、4E4是抗H9亚型禽流感病毒HA特异性的单克隆抗体,2株阳性杂交瘤细胞的培养上清及腹水对禽流感病毒FT株的HI效价分别为24、29和25、210。6株阳性杂交瘤细胞的培养上清及腹水对禽流感病毒FT株的ELISA效价分别为103、104、105、105、106、105和106、107、108、108、109、108。特异性试验表明该6株单抗均不与其他常见的禽类病毒和H5、H7亚型禽流感病毒发生交叉反应。单抗5B10和4F3亚类皆为IgA,4H12和4A7亚类为IgG1,4E4亚类为IgG2a,1D10亚类为IgG2b。相加间接ELISA试验表明,单抗4F3和5B10对应于同一抗原表位,另4株针对不同抗原表位。6株单抗对禽流感H9亚型FT毒株均没有中和活性。选取效价高的单克隆抗体4E4利用HiTrapTM Protein G亲和层析柱纯化后,作为建立双抗体夹心ELISA方法的捕获抗体。确定夹心ELISA试验中单抗的最适工作浓度为5μg/ml,标准阴阳性抗原稀释倍数为1：10。酶标多抗的最佳稀释度为1：300,最适浓度为9μg/ml。捕获单抗的最适包被条件为37℃包被1h后4℃过夜,选用3%BSA作为封闭液,最佳封闭时间为1.0h。抗原的反应时间为1.0h,酶标抗体最佳作用时间为1.0h,最佳显色时间为15min。用建立的双抗体夹心ELISA方法与NDV、IBV、IBDV、ILTV和FPV以及H5、H7亚型禽流感病毒进行交叉反应性试验,结果表明：H9亚型禽流感病毒双抗体夹心ELISA方法与其他禽类病毒及H5、H7亚型禽流感病毒均没有明显的交叉反应性,说明该方法对H9亚型流感病毒具有高度的特异性。优化好的ELISA反应体系检测近年来H9亚型禽流感病毒不同分离毒株的覆盖率很广,检测18个已经分离到H9亚型禽流感病毒的临床病料全部显强阳性反应,表明建立的双抗体夹心ELISA方法特异性良好,具有很高的精确性和敏感性。重复性实验表明,同一样品的板内和板间的变异系数均小于10%。将包被的酶标板及酶标抗体和标准阴阳性抗原组装成简易试剂盒,同时保存于室温、4℃和—20℃,定期进行检测,结果表明：试剂盒在室温保存时极不稳定,保存期限不超过1个月,4℃可保存3个月,在—20℃稳定保存4个月以上。