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研究背景:在发达国家中,前列腺癌是男性最为常见的恶性肿瘤,在肿瘤相关死亡的病因中排名第二。目前雄激素剥夺治疗是转移性前列腺癌治疗中的金标准。尽管大部分患者在治疗早期会取得较好的治疗效果,但随时间进展往往会出现药物耐受,即我们通常所称的去势抵抗性前列腺癌。目前针对雄激素受体信号的二代抗雄药物能够延长患者的生存期,但患者从中获益的时间有限。部分患者出现雄激素受体功能的异常激活,表现为雄激素受体阳性的去势抵抗性前列腺癌;另一部分患者表现为雄激素受体非依赖性增殖,并表达神经内分泌标志,被称为神经内分泌前列腺癌。神经内分泌前列腺癌侵袭性强,死亡率高,因发病机制不清而缺乏有效治疗手段,是导致前列腺癌患者死亡的主要原因。因此,探讨前列腺癌发生神经内分泌分化的分子机制,将有助于患者获益。原发性神经内分泌前列腺癌仅占2%左右,而经过雄激素剥夺治疗后,神经内分泌前列腺的发生率升高至20%-30%。这说明雄激素剥夺治疗导致的压力诱导与神经内分泌前列腺癌的发生之间存在紧密联系。目前大量文献提示表观调控介导的谱系重塑在神经内分泌前列腺癌的发生中发挥重要作用。而雄激素剥夺治疗与前列腺癌谱系重塑进而发展至神经内分泌前列腺癌之间联系的的机制尚不明确。因此,探索雄激素剥夺治疗如何通过表观调控诱导前列腺癌神经内分泌性转分化,进而发现治疗神经内分泌前列腺癌的新策略,具有重要的临床和科研意义,将为该疾病的诊断和治疗提供有效的靶标。研究材料和方法:1.体外模型:利用多种前列腺癌细胞系,诸如LnCaP,PC-3,NE1.3等,构建PHF8敲低或过表达细胞系,观察增殖,迁移等指标的变化。2.体内模型:(1)采用分别为去势抵抗性前列腺癌和神经内分泌前列腺癌的人源性肿瘤移植瘤模型,观察其中相关指标差异。(2)采用自发前列腺癌的转基因小鼠TRAMP模型,分为野生型TRAMP和PHF8敲除的TRAMP小鼠两组,分别在12w,25w,37w观察其疾病进展和相关指标差异。(3)分别采用PC-3对照和PHF8敲低细胞系构建裸鼠移植瘤模型,观察PHF8对移植瘤增殖的作用及相关指标的差异。3.病人标本:收集不同Gleason评分的前列腺癌患者标本以制作组织芯片,观察相关指标差异;收集在雄激素剥夺治疗前为前列腺腺癌、雄激素剥夺治疗后为神经内分泌前列腺癌的患者标本,使用免疫组化等方法检测相关指标的变化;利用公共数据库的患者信息,通过数据分析的方法观测相关指标的差异。4.实验方法:利用了划痕实验、克隆形成、侵袭和迁移实验、免疫组化、免疫荧光、免疫共沉淀、Western blot、染色质免疫共沉淀、荧光素报告基因检测、RNA-seq等。研究结果:1.PHF8敲除在TRAMP小鼠中显著抑制神经内分泌前列腺癌的发生,但不影响前列腺腺癌的发生。通过在12w、25w、37w分别观察野生型TRAMP小鼠和PHF8敲除的TRAMP小鼠的疾病进展,我们发现,相对于野生型的TRAMP小鼠,PHF8敲除的TRAMP小鼠,在前列腺上皮内瘤变的形成和前列腺腺癌的发生方面没有显著的差异,但出现了神经内分泌前列腺癌发生的显著的降低,表明PHF8在前列腺上皮内瘤变形成和前列腺腺癌发生方面没有显著作用,但对神经内分泌前列腺癌的发生具有重要的作用。2.PHF8敲低能够抑制神经内分泌前列腺癌细胞在体外的增殖、迁移和侵袭能力。通过构建野生型和PHF8敲低的PC-3和NE1.3细胞系,我们发现PHF8敲低能够显著降低前列腺癌细胞系的增殖能力,抑制侵袭和迁移能力。通过构建野生型和PHF8敲低与过表达的LNCaP细胞系,我们发现,PHF8敲低能够抑制前列腺腺癌的增殖、侵袭和迁移能力,而过表达PHF8可以增强前列腺腺癌细胞的增殖能力,还可以增强其对比卡鲁胺和恩杂鲁胺的耐药性。3.PHF8通过转录调控FOXA2表达影响神经内分泌前列腺癌的发生。通过RNA-seq的方法,我们发现PHF8敲除的小鼠与野生型TRAMP小鼠相比,其神经内分泌的特征被显著的降低了,而神经内分泌前列腺癌发生中的驱动因子之一——FOXA2出现了明显的降低。利用体外细胞系和体内模型,我们进一步验证了,PHF8敲低显著降低了FOXA2的表达,并导致神经内分泌标志的下降,而FOXA2的过表达则可以逆转神经内分泌标志的下降。利用荧光素酶报告基因检测和染色质免疫共沉淀的方法,我们进一步证实了,PHF8与FOXA2的启动子序列相结合,利用表观调控的方式调控FOXA2的表达。4.在临床神经内分泌前列腺癌的病人标本中,PHF8和FOXA2表达明显升高。我们进一步利用公共数据库信息、患者标本和病人来源肿瘤移植瘤模型,分析了PHF8和FOXA2在前列腺腺癌、去势抵抗性前列腺腺癌和神经内分泌前列腺癌之间的差异,发现PHF8和FOXA2在神经内分泌前列腺癌中的表达明显升高,证实这两个指标可以作为神经内分泌前列腺癌的临床指标。结论:神经内分泌前列腺癌恶性程度高,侵袭性强,是终末期前列腺癌的治疗难点。因对其发生机制的认识欠清晰,早期筛查和治疗手段比较缺乏。在本研究中,我们首次使用PHF8敲除的TRAMP小鼠模型研究了PHF8在神经内分泌前列腺发生中的作用,探讨了此前未曾报告过的PHF8/FOXA2轴参与神经内分泌前列腺癌发生的机制。我们的研究揭示了,PHF8通过去甲基化酶的作用转录调控FOXA2表达升高,从而介导神经内分泌前列腺癌的发生。结合此前我们的发现——去雄激素治疗可以引起PHF8的表达升高,为去雄激素治疗与表观遗传因子调控介导前列腺癌神经内分泌转分化之间提供了桥梁,揭示了去雄激素治疗诱导PHF8表达升高,继而转录上调FOXA2的表达,最终完成前列腺癌神经内分泌转分化的分子机制。以上结果说明去雄激素治疗联合PHF8抑制,可以抑制或延迟前列腺癌神经内分泌转分化,具有重要的临床和科学意义。本研究为洞悉神经内分泌前列腺癌的发生机制提供了新的见解,为神经内分泌前列腺癌的早期诊断和探索新的治疗策略提供了新的靶标。