液滴微流控技术,具有体积小,样品消耗少,分析速度快,灵敏度高等优势,已成为化学分析领域中一种重要的单分子分析方法,本文发展了一种琼糖液滴微流控技术,用于对单分子RNA/细胞进行液滴内反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),并通过流式细胞仪分析检测,实现了对单分子/细胞的高通量分析检测。　　 本文以低凝胶点琼脂糖溶液为水相,以疏水改性后的双水相通道玻璃微流控芯片为液滴生成器,制备单分散的油包琼脂糖液滴,同时将RT-PCR所需反应物和经逐级稀释的模板RNA/细胞包裹进琼脂糖液滴内进行单分子RT-PCR扩增。通过将引物偶联到线性聚丙烯酰胺分子上,克服了传统油包水液滴内PCR由于磁性微球的引入带来的扩增效率低以及有效液滴产生效率低的缺陷,同时可将扩增后的产物“囚禁”在琼脂糖液滴内。经过去油、荧光染料染色后,含有模板分子/细胞的微球在激光下发出荧光,用显微镜成像、流式细胞等分析手段进行后续表征,实现了单分子/细胞的高通量高效率分析。同时,本文还对在新型油包水凝胶体系进行单分子聚合酶链式反应(PCR)进行了探索。　　 具体研究内容及结果如下:　　 第二章中,制作了双水相通道流聚焦型玻璃微流控芯片,经疏水处理后,以2％的低熔点琼脂糖溶液为水相,混合硅油为油相在芯片中形成了大小均一可调的油包琼脂糖液滴,两水相琼脂糖可在生成的液滴中快速混匀。2％的琼脂糖液滴经过30轮的热循环仍能够保持良好的单分散性,说明琼脂糖液滴具有良好的热稳定性。4℃冷却充分凝胶后,通过多种有机试剂依次除去琼脂糖周围的油相,最终得到能在水中长期稳定保存的琼脂糖凝胶微球,具有稳定的机械性能,适用于后续的显微镜观察和流式分析。　　 第三章中,建立了油包琼脂糖单分子RNA液滴RT-PCR技术,荧光染料对琼脂糖微球染色之后,通过荧光显微镜或流式分析实现了单分子RNA的高通量分析。基于本课题组之前发展的琼脂糖液滴微流控PCR技术,本章提出了用于高通量单分子RNA分析检测的油包琼脂糖液滴微流控技术。采用线性聚丙烯酰胺代替琼脂糖大分子作为引物偶联载体,不仅有效避免了由于磁性微球的引入导致扩增效率低和有效液滴数产生效率低的缺陷,且相对于引物通过希夫碱反应共价偶联到琼脂糖分子上的偶联方式,共价聚合偶联到线性聚丙烯酰胺的方法更快速简单,偶联产率更高,偶联后不会影响扩增反应。扩增后去油并荧光染料染色后通过荧光显微成像或流式分析实现了对单分子RNA的高通量分析检测。用荧光定量PCR对琼脂糖液滴内RT-PCR扩增效率进行表征,实验结果表明在这种油包琼脂糖液滴内有很高的扩增效率,1.5拷贝/液滴的琼脂糖液滴经过29轮的扩增反应每一轮的扩增效率可达80.1％。　　 第四章中,开发了一种单细胞基因表达水平分析技术。基于第三章琼中脂糖液滴内单分子RNA的分析技术,本文对单细胞基因表达水平进行了分析研究。EpCAM蛋白(epithelial cell adhesion molecule)在多数癌变细胞中是一种高表达蛋白,且已经被科学家们公认为癌细胞肿瘤标记物。本文以EpCAM表达量不同的两种细胞做为研究对象,通过微流控芯片将RT-PCR所需反应物、细胞和细胞裂解液包裹于同一个液滴内,细胞裂解后进行RT-PCR扩增,扩增后去油、荧光染料染色并用流式细胞仪对其分析,首次实现了液滴内的单细胞水平的高通量分析检测。该技术在后续的细胞基因表达分析,癌症等疾病的早期诊断方面具有良好的应用前景。　　 第五章中,进行了新型油包水凝胶体系中单分子扩增技术可行性探索。海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酰胺等具有良好的生物兼容性,且其粘度比较低,易于在室温下产生单分散好的液滴,液滴易于固化凝胶。本文对海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和聚丙烯酰胺三种水凝胶体系单分子扩增进行了探索,发现:1)海藻酸钠体系不能用于DNA的扩增;2)羧甲基纤维素钠对PCR扩增没有影响,且易于在微流控芯片上产生单分散液滴,液滴易于成胶,但是成胶过程中液滴严重缩水,包裹的物质会泄露,解决办法之一是将PCR扩增反应物偶联到大分子上;3)聚丙烯酰胺凝胶能进行PCR扩增,油包丙烯酰胺液滴也可成胶。新型油包水凝胶体系由于其在微反应之后可固化成胶,大大方便了后续的分离分析,在液滴微流控分析领域具有良好的应用前景。