一、研究背景与目的肺癌是世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一,放射治疗是肺癌治疗的重要手段。但是接受放疗后,60%以上的肺癌患者肿块仍有残存,残存的肿瘤细胞是肺癌复发及转移的根源,远处转移更是肺癌患者死亡的最主要原因,因此,研究辐射后存活肿瘤细胞的侵袭及转移能力的变化具有重要的临床价值及意义。多数研究结果表明,放疗后存活肿瘤细胞的侵袭性增强,但是也有少数研究发现放疗后存活癌细胞的侵袭性降低,因此,关于辐射对肿瘤细胞的侵袭及转移能力的影响仍有争议。为了明确肺癌辐射后存活肿瘤细胞的侵袭及转移能力是否增高,我们选用具有高转移潜能的A549肺腺癌细胞系作为研究对象,从体外粘附、侵袭、迁移实验,体内肺转移模型观察了辐射后细胞转移能力的变化,并对其机制进行了初步探讨。这将为我们进一步采取相应的对策,降低辐射诱导的肿瘤转移能力增强,提供理论依据。我们通过多年的研究及临床应用发现,当归可以有效地预防及治疗放射性肺炎,因此在放疗期间及放疗后常常使用当归。许多研究发现,当归及其当归属的提取物具有诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤作用,还有研究发现,当归的提取物可以抑制肿瘤的侵袭与转移。当归治疗放射性肺炎的机制之一与其抑制放射诱导的TGF-B1增高有关。因此,我们推测,当归可能通过影响TGF-β1表达,进而影响辐射后存活肿瘤细胞的侵袭及转移能力。但是当归属于活血化瘀类的中药,有研究认为此类药物可以促进肿瘤细胞血行转移,临床上治疗肿瘤一般不宜单用活血化瘀类的中药。因此当归是否能够抑制辐射后的肿瘤细胞的侵袭及转移能力,还是个未知数。本实验首先检测了当归对辐射后存活肺腺癌细胞A549体内外侵袭及转移能力的影响,然后进一步探讨了其作用机制。此研究将为当归的临床应用提供理论依据,具有重要的意义。二、研究方法及结果1.我们通过MTT细胞粘附实验、Transwell细胞侵袭及迁移实验观察了辐射后存活A549肿瘤细胞的体外粘附、侵袭及迁移能力的变化；采用裸鼠肺转移模型观察辐射后存活A549肿瘤细胞的体内肺转移能力的变化。结果提示：辐射后存活A549肿瘤细胞的粘附、侵袭及迁移能力均明显增强,约为辐射前的1.46倍、1.4倍及1.45倍。其体内肺转移能力亦明显增强,约为辐射前的1.2倍。2.我们通过显微镜观察,发现辐射后存活A549肿瘤细胞出现显著的EMT形态学变化：细胞间隙增大,向纺锤样间质细胞形态演变,并有多而长的伪足形成。通过荧光定量RT-PCR及West blot法,检测了辐射前及辐射后存活A549肿瘤细胞E-Cadherin和Vimentin表达的变化。结果提示：辐射后细胞出现E-Cadherin的1mRNA的表达下调,约为对照组的59.4%；细胞的E-Cadherin蛋白表达也相应降低,约为对照组的74.6%。而Vimentin的1mRNA的表达则出现了上调,较辐射前增高约1.37倍,细胞内的Vimentin蛋白也相应增高,约为辐射前的1.6倍。提示辐射后残留的A549肿瘤细胞的转移能力增强可能与辐射诱导EMT的发生有关。3.我们采用荧光定量RT-PCR, West blot及ELISA方法检测发现辐射后存活A549细胞的TGF-β1的mRNA表达水平明显升高,约为对照组的2.37倍,分泌至细胞外的TGF-β1约为对照组的2.34倍,细胞内的蛋白也相应增高,约为对照组的1.8倍。提示辐射可能通过诱导A549细胞的TGF-β1表达,导致EMT的发生。4.我们采用荧光定量RT-PCR检测了细胞MMP-2及MMP-9的mRNA的表达,用West blot方法检测了细胞内的MMP-2及MMP-9蛋白的表达。结果发现辐射后存活的A549肿瘤细胞的MMP-2及MMP-9的：mRNA表达均增高,约为对照组的1.8倍及1.5倍。细胞的MMP-2及MMP-9的表达蛋白也相应均增高,约为对照组的1.1倍及1-2倍。提示辐射后残留的A549细胞的转移能力增强可能与辐射诱导MMP表达增强有关。5.为了明确当归对辐射后存活A549细胞的增殖能力的影响,我们采用CCK-8细胞增殖抑制实验进行了观察。研究结果显示,与对照组相比,当细胞培养基中当归的浓度分别为2.5mg/ml,10mg/ml时,对辐射后存活的A549细胞的增殖没有显著的影响,即使当归达到最大浓度(25mg/ml)作用48小时后,其才对细胞的增殖有微弱抑制。提示中、低浓度的当归对辐射后存活的A549肿瘤细胞的增殖及生长没有促进作用,高浓度的当归对A549细胞的增殖具有轻度的抑制作用。6.我们通过MTT细胞粘附实验、Transwell细胞侵袭及迁移实验检测当归对辐射后存活A549细胞体外粘附、侵袭及迁移运动能力的变化,研究结果提示当归呈剂量依赖式的抑制细胞体外的粘附、侵袭及迁移能力；我们采用裸鼠肺转移模型观察细胞的体内转移能力的变化,结果显示低浓度的当归对细胞的体内肺转移能力没有明显的影响,而中、高浓度的当归则可以明显抑制细胞的肺转移。7.我们检测了当归对A549细胞EMT标志物E-cadherin及Vimentin表达的影响。结果显示各个浓度的当归对E-cadherin的mRNA表达及细胞内的蛋白水平均无明显影响。25mg/ml的高浓度当归可以抑制Vimentin的mRNA表达及细胞内的蛋白水平,但是在低中浓度则对Vimentin无明显影响,提示高浓度的当归对细胞的转移抑制作用可能与其抑制Vimentin的表达有关,表明当归的成分是复杂的,对Vimentin的调控机制可能涉及多个水平,多个机制。也提示当归抑制肿瘤细胞的转移与其抑制EMT关系可能不大,细胞形态学也证实了这点(文中未显示),当归作用后细胞的形态变化不大。8.我们采用荧光定量RT-PCR检测了A549肿瘤细胞TGF-β1的mRNA的表达,用Western blot方法检测了细胞内的TGF-β1蛋白水平,用ELISA方法检测了分泌至细胞外培养液中的TGF-β1水平。结果显示,当归可以明显抑制A549肿瘤细胞的TGF-β1表达,这种抑制作用随着当归的浓度增高而增强。10mg/ml及25mg/m的当归作用于细胞24h后,分泌至细胞外的TGF-B1明显减少,约为对照组的73%及56%；细胞内的TGF-B1蛋白表达减少,约为对照组的69%及58%；细胞TGF-B1的mRNA表达同样减少,约为对照组的74%及60%,提示当归可以抑制细胞的TGF-β1表达及分泌,其抑制作用可能在转录水平以上。9.我们用明胶酶谱法检测当归对了A549细胞MMP-2及MMP-9活性的影响。结果显示当归可以明显抑制细胞的MMP-2及MMP-9活性,这种抑制作用随着当归的浓度增高而增强。1Omg/ml及25mg/m的当归作用于细胞24h后,A549细胞的pro-MMP-2及active-MMP活性均明显降低,约为对照组的70%、52%及62、%43%；并且细胞的MMP-9活性同样降低,约为对照组的66%及38%,提示当归可以明显抑制A549肿瘤细胞MMP-2及MMP-9的活性。其次我们采用ELISA方法检测了分泌至培养液中的MMP-2及MMP-9的量。结果显示,当归可以明显抑制细胞MMP-2及MMP-9的分泌,这种抑制作用随着当归的浓度增高而增强。10mg/ml及25mg/m的当归作用于细胞24h后,分泌至细胞外的MMP-2较对照组减少,约为对照组的52%及43%；细胞外的MMP-9同样降低,约为对照组的59%及37%。提示当归抑制细胞的MMP-2及MMP-9的活性与其抑制MMP-2及MMP-9的分泌有关。最后,我们采用荧光定量RT-PCR检测了当归对A549肿瘤细胞MMP-2及MMP-9的mRNA的表达的影响,用Western blot方法检测了当归对细胞内的蛋白水平的影响。结果显示,当归可以明显抑制MMP-2及MMP-9的mRNA的表达及细胞内蛋白的表达,这种抑制作用随着当归的浓度增高而增强。10mg/ml及25mg/m的当归作用于细胞24h后,细胞内MMP-2的mRNA表达约为对照组的82%及59%,细胞内MMP-9的mRNA表达同样降低,约为对照组的56%及53%；细胞内MMP-2的蛋白表达约为对照组的77%及26%,细胞内MMP-9的蛋白表达约为对照组的50%及44%。提示当归可以明显抑制细胞的MMP-2及MMP-9的mRNA及蛋白的表达,当归对A549细胞MMP的抑制作用可能在转录以上的水平。10.最后,我们用ELISA法检测了细胞外培养液中TIMP-1及TIMP-2的量。结果显示,当归可以明显增高分泌至细胞外TIMP-2的量,这种增高作用随着当归的浓度增高而增强,即使最低浓度的当归(2.5mg/ml)作用后,TIMP-2的量即较对照组增加约1.68倍。但是当归对TIMP-1则是抑制作用,1Omg/ml及25mg/m的当归作用于细胞24h后,而细胞外的TIMP-1则降低,约为对照组的74%及52%。RT-PCR检测结果同样提示,当归可以明显增强TIMP-2的mRNA表达,即使最低浓度的当归作用后,可使细胞的mRNA表达增加2.4倍。而TIMP-1的表达则随当归的浓度增加而下降。这个矛盾的结果提示当归对MMP-2及MMP-9活性抑制作用(特别是MMP-2)与TIMP-2的增加有关,而与TIMP-1无关。三、结论1.辐射后存活的A549细胞的侵袭及转移能力较辐射前明显增强,其机制可能与辐射诱导TGF-β1,进而促进肿瘤细胞的EMT有关,还可能与辐射诱导MMP-2及MMP-9的表达增强有关。2.中、低浓度的当归对辐射后存活的A549肿瘤细胞的增殖及生长没有影响,高浓度的当归对A549细胞的增殖具有轻度的抑制作用。3.当归可以呈剂量依赖式的抑制辐射后存活的A549细胞的体内外转移能力,其机制可能与当归抑制TGF-β1、MMP-2及MMP-9的表达,增强TIMP-2的表达有关,而与EMT及TIMP-1的关系不大。4.对患者而言,在肺癌放疗的同时使用当归治疗及预防放射性肺炎是安全的,它对肿瘤没有促进作用,可能还会降低肿瘤的转移风险。